Bactériologie systématique (partie 2/3)

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de : - Décrire le principe, le matériel et les étapes de l’hémoculture, de la coptoculture et de la bactériologie du prélèvement cervico‑vaginal. - Réaliser, en respectant les bonnes pratiques de laboratoire, un prélèvement, son inoculation, son incubation et la lecture des résultats. - Interpréter les résultats en lien avec la pathologie suspectée (bactériémie, infection entérique, infection génitale). - Appliquer les règles de biosécurité (niveau 2) et d’hygiène liées à chaque type de prélèvement. - Résoudre des exercices d’application mettant en jeu des calculs de dilution, de temps d’incubation ou d’interprétation de profils biochimiques. **Prérequis** : Connaissances de base en microbiologie générale (structure bactérienne, milieux de culture, incubation, identification biochimique), notions d’asepsie, de manipulation sécurisée des échantillons biologiques et de lecture des résultats (test de catalase, coagulase, oxydase, API 20E, etc.). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les laboratoires de biologie médicale sont confrontés quotidiennement à la détection des agents pathogènes responsables de septicémies, de diarrhées aiguës et d’infections génitales. Les techniques d’hémoculture, de coptoculture et de bactériologie du prélèvement cervico‑vaginal constituent le socle du diagnostic microbiologique de ces pathologies. Maîtriser ces procédures permet non seulement d’orienter la thérapeutique antibiotique, mais aussi de participer à la surveillance épidémiologique (ex. : suivi des résistances aux antibiotiques dans les hôpitaux de référence). Ce chapitre s’inscrit dans l’approche par compétences du programme MINESEC/IGE : l’élève doit être capable de réaliser l’acte technique, d’en assurer la qualité et d’en rendre compte de façon professionnelle. --- ## I. Hémoculture (Leçon 10) ### Définition et objectifs L’hémoculture consiste à détecter la présence de bactéries ou de levures dans le sang d’un patient suspecté de septicémie. Son objectif est d’isoler l’agent étiologique afin de guider l’antibiothérapie et de prévenir les complications graves (choc septique, métastases infectieuses). > L’hémoculture est considérée comme le « gold‑standard » pour le diagnostic de bactériémie. ### Principe de la méthode Un volume défini de sang (généralement 5–10 ml) est prélevé sous asepsie stricte et inoculé dans des flacons contenant un milieu liquide enrichi (brain‑heart infusion + anticoagulant + agents de neutralisation des antibiotiques). Après incubation à 37 °C en atmosphère aérobie et/ou anaérobie, la croissance microbienne est détectée soit par une augmentation de la turbidité, soit par un indicateur de CO₂ (système colorimétrique ou fluorimétrique). ### Matériel et réactifs - Aiguille papillon 21 G, garrot, alcool 70 %, povidone‑iodée. - Flacons d’hémoculture aérobie et anaérobie (ex. : BACTEC Plus Aerobic/FAN, Anaerobic Lytic/10). - Incubateur à 37 °C avec agitation douce (ou système automatisé BACTEC). - Lecteur de fluorescence/turbidité ou inspection visuelle quotidienne. ### Procédure pas à pas 1. **Préparation du patient** : appliquer un garrot, désinfecter le site de ponction avec alcool puis povidone‑iodée (temps de contact ≥ 30 s), laisser sécher. 2. **Prélèvement** : réaliser la ponction veineuse avec une aiguille papillon, prélever 5 ml de sang dans chaque flacon (aérobie puis anaérobie) sans changer d’aiguille. 3. **Inoculation** : inverser doucement les flacons pour mélanger le sang avec le milieu. 4. **Étiquetage** : indiquer nom, date, heure, type de flacon, numéro de lot. 5. **Incubation** : placer les flacons dans l’incubateur à 37 °C, agitation légère. 6. **Surveillance** : vérifier quotidiennement la présence de croissance (turbidité, changement de couleur du capteur). 7. **Subculture** : dès détection positive, réaliser un Gram‑coloration directe du bouillon, puis ensemencer sur géloses appropriées (sang, chocolat, MacConkey) pour isolement et identification. 8. **Incubation secondaire** : 24–48 h à 37 °C selon le milieu. ### Interprétation des résultats - **Négatif** : aucune croissance après 5 jours (ou selon le protocole du système automatisé). - **Positif** : croissance détectée ; identifier l’espèce et réaliser un antibiogramme. - **Contamination** : présence de flore cutanée habituelle (Coagulase‑négative staphylocoques, Corynebacterium spp.) isolée dans un seul flacon ou avec faible densité ; interpréter avec prudence. ### Normes de sécurité et de biosécurité - Manipulation sous flux laminaire ou dans une boîte de sécurité de niveau 2 (BSL‑2) pour les flacons positifs. - Port de gants, blouse, lunettes de protection ; éviter les éclaboussures. - Décontamination des flacons usagés par autoclave (121 °C, 15 min) avant élimination. ### Exemple d’atelier au laboratoire de microbiologie médicale du CHU de Yaoundé Lors d’une garde de nuit, un patient fébrile (39 °C) reçoit deux jeux d’hémoculture. Après 18 h, le flacon aérobie signale une croissance. Le Gram montre des cocci à Gram positif en grappes. L’identification par API Staph révèle *Staphylococcus aureus* sensible à l’oxacilline. L’antibiogramme confirme la sensibilité à la cefazoline. Le traitement est adapté et le patient est sorti guéri au 5ᵉ jour. --- ## II. Coptoculture (Leçon 11) ### Définition et objectifs La coptoculture (ou culture des selles) vise à isoler les bactéries entériques pathogènes responsables de diarrées aiguës, de dysenterie ou d’intoxications alimentaires. Elle permet de confirmer une étiologie infectieuse et d’orienter la prise en charge (réhydratation, antibiothérapie ciblée). > Les principaux pathogènes recherchés sont *Salmonella* spp., *Shigella* spp., *Campylobacter jejuni/coli*, *Escherichia coli* productrice de toxines Shiga (STEC) et *Vibrio cholerae*. ### Principe de la méthode Un échantillon de selles frais est inoculé sur des milieux sélectifs et différentiels qui inhibent la flore commensale tout en favorisant la croissance des pathogènes visés. Après incubation, les colonies suspectes sont soumises à des tests biochimiques (API 20E, triple sucre fer, uréase) ou à des méthodes moléculaires (PCR) pour l’identification définitive. ### Matériel et réactifs - Écouvillon rectal ou spatule stérile. - Milieux de transport (Cary‑Blair) si délai > 2 h. - Géloses sélectives : XLD (xylose lysine désoxycholate), Hektoen enterique, MacConkey, Skirrow pour *Campylobacter*, TCBS pour *Vibrio*. - Incubateur à 37 °C (aérobie) et/ou 42 °C sous microaérophilie pour *Campylobacter*. - Kits API 20E, réactifs pour oxydase, catalase, uréase. ### Procédure pas à pas 1. **Collecte** : demander au patient de déféquer dans un récipient propre, prélever une quantité fécale de la taille d’un pois avec l’écouvillon ou la spatule, placer immédiatement dans le milieu de transport si nécessaire. 2. **Inoculation** : étaler un petit montant de matière fécale sur chaque gélose sélective en utilisant une boucle stérile (technique de quadrillage). 3. **Incubation** : - XLD, Hektoen, MacConkey : 37 °C, aérobie, 18–24 h. - Skirrow (pour *Campylobacter*) : 42 °C, atmosphère microaérophile (5 % O₂, 10 % CO₂, 85 % N₂), 48 h. - TCBS (pour *Vibrio*) : 37 °C, aérobie, 18–24 h. 4. **Lecture** : observer la couleur et la morphologie des colonies (ex. : colonies roses avec centre noir sur XLD = *Salmonella* ou *Shigella*). 5. **Tests biochimiques** : prélever une colonie suspecte, réaliser le test d’oxydase, puis l’API 20E selon le protocole du fabricant. 6. **Confirmation** : en cas de doute, réaliser un test de agglutination avec sérums spécifiques ou une PCR multiplex. ### Interprétation des résultats - **Positif** : isolement d’un pathogène entérique confirmé par les tests biochimiques ou moléculaires. - **Négatif** : absence de croissance après les délais d’incubation ; considérer une étiologie virale, parasitaire ou toxinique si les signes cliniques persistent. - **Flore commensale abondante** : peut masquer la croissance des pathogènes ; répéter l’échantillonnage avec un milieu de transport amélioré. ### Sécurité - Manipulation des selles sous hotte de sécurité biologique (BSL‑2) en raison du risque de pathogens transmissibles par voie fécale‑orale. - Port de gants, blouse, masque facial si risque d’aérosolisation (ex. : vortexage). - Décontamination des surfaces avec solution d’hypochlorite 0,5 % après chaque manipulation. ### Exemple de chantier : enquête sur une intoxication alimentaire dans une école de Douala Après un repas servi à la cantine, 30 élèves présentent des vomissements et diarrhées. Des prélèvements de selles sont réalisés et inoculés sur XLD et Skirrow. À 24 h, des colonies translucides avec bord noir apparaissent sur XLD ; l’API 20E indique *Salmonella* Enteritidis. Le test de agglutination confirme le sérotype. L’enquête révèle une mauvaise conservation de la volaille. Les autorités sanitaires ordonnent la destruction du lot suspect et la formation du personnel de cuisine sur les bonnes pratiques d’hygiène. --- ## III. Bactériologie du prélèvement cervico‑vaginal (Leçon 12) ### Définition et objectifs L’examen bactériologique du prélèvement cervico‑vaginal permet de détecter les agents responsables d’infections sexuellement transmissibles (IST) et de vaginites bactériennes ou fongiques. Les objectifs sont : identifier *Neisseria gonorrhoeae*, dépister une surcroissance de *Gardnerella vaginalis* (vaginose bactérienne), rechercher *Candida* spp. (candidiase) et, selon le contexte, détecter *Chlamydia trachomatis* par méthodes moléculaires (la culture étant rarement utilisée pour ce germe). > La culture de *N. gonorrhoeae* reste la référence pour confirmer la gonorrhée lorsqu’elle est réalisable. ### Principe de la méthode Un écouvillon est prélevé au niveau du col utérin et/ou du vagin, placé dans un milieu de transport adapté (Stuart ou Amies) puis ensemencé sur des milieux sélectifs favorisant la croissance des germes d’intérêt tout en inhibant la flore commensale. Après incubation, les colonies sont identifiées par leurs caractéristiques morpho‑culturelles, leurs réactions biochimiques (oxydase, catalase, utilisation du glucose, maltose, lactose) et, si nécessaire, par spectrométrie de masse MALDI‑TOF. ### Matériel et réactifs - Écouvillon en plastique avec embout en rayon ou en alginate. - Milieu de transport Stuart (pour bactéries anaérobies et aérobies) ou Amies (pour *N. gonorrhoeae*). - Géloses sélectives : - Chocolate agar + antibiotiques (vancomycine, colistine, nystatine) pour *N. gonorrhoeae* et *Haemophilus* spp. - Gélose de Thayer‑Martin (chocolate agar + vancomycine, colistine, nystatine, triméthoprime) – sélective pour gonocoques. - Gélose de Gardnerella (ou milieu de BV) pour *Gardnerella vaginalis* et *Mobiluncus* spp. - Sabouraud chloramphenicol pour *Candida* spp. - Incubateur à 35–37 °C, atmosphère enrichie en CO₂ (5–10 %) pour *N. gonorrhoeae*. - Réactifs oxydase, catalase, tests de fermentation des sucres (API Staph, API Coryne). - Kit MALDI‑TOF ou système d’identification automatisé (optionnel). ### Procédure pas à pas 1. **Prélèvement** : avec spéculum, exposer le col, frotter doucement l’écouvillon sur la muqueuse endocervicale (et/ou le fornix vaginal) pendant 10–15 s, placer immédiatement dans le tube de transport. 2. **Transport** : maintenir à température ambiante, livrer au laboratoire dans les 2 h (ou réfrigérer à 4 °C si délai plus long, mais pas > 24 h). 3. **Inoculation** : rouler l’écouvillon sur la surface de chaque gélose sélectionnée en effectuant des stries quadrillées. 4. **Incubation** : - Chocolate agar/Thayer‑Martin : 35–37 °C, 5–10 % CO₂, 24–48 h. - Gélose Gardnerella : 35–37 °C, anaérobie (ou atmosphère réduite) 48 h. - Sabouraud : 25–30 °C, 48–72 h. 5. **Lecture** : observer la couleur, la taille, l’hémolyse, l’odeur (ex. : odeur « poisson » pour *Gardnerella*). 6. **Tests biochimiques** : réaliser le test d’oxydase (positif pour *N. gonorrhoeae*), la catalase, puis les fermentations de sucres selon le schéma API Coryne ou Staph. 7. **Identification** : confirmer *N. gonorrhoeae* par oxydase+, fermentation du glucose uniquement, colonie gris‑bleu sur chocolate, sensibilité à la pénicilline (test de diffusion). 8. **Antibiogramme** (si nécessaire) : diffusion sur Mueller‑Hinton sang avec antibiotiques usuels (céftriaxone, spectinomycine, azithromycine). ### Interprétation des résultats - **Positif pour *N. gonorrhoeae*** : diagnostic de gonorrhée ; traitement selon les recommandations nationales (céftriaxone 500 mg IM en dose unique + azithromycine 1 g PO). - **Positif pour *Gardnerella vaginalis* avec flore mixte et pH vaginal > 4,5** : vaginose bactérienne ; traitement par métronidazole oral 500 mg 2×/j pendant 7 j ou gel vaginal. - **Positif pour *Candida* spp.** (colonies blanches, crémeuses, pseudomyceles au KOH) : candidiase vulvo‑vaginale ; traitement par fluconazole 150 mg PO en dose unique ou clotrimazole vaginal. - **Négatif** : aucune croissance significative ; considérer d’autres étiologies (virus, parasites) ou un prélèvement de mauvaise qualité. ### Sécurité - Manipulation des écouvillons sous hotte de sécurité biologique (BSL‑2) en raison du risque de transmission de *N. gonorrhoeae* et d’autres IST. - Port de gants, blouse, protection oculaire ; éviter les éclaboussures lors du vortexage des écouvillons. - Décontamination des surfaces avec solution d’alcool à 70 % ou hypochlorite 0,1 % après chaque série de prélèvements. ### Exemple de situation professionnelle : consultation prénatale au centre de santé de Bertoua Une femme enceinte de 28 semaines présente des pertes vaginales blanches et une légère démangeaison. Un prélèvement cervico‑vaginal est réalisé et ensemencé sur chocolate agar + antibiotiques et sur Sabouraud. À 24 h, aucune croissance sur chocolate, tandis que sur Sabouraud apparaissent des colonies levuriformes blanches. Le test au KOH révèle des hyphes et des spores : identification de *Candida albicans*. La patiente reçoit un ovule de clotrimazole 500 mg à appliquer pendant 3 nuits ; les symptômes disparaissent en 48 h. --- ## Synthèse du chapitre - **Hémoculture** : détection de bactériémie, prélèvement de 5–10 ml de sang sous asepsie, inoculation dans flacons aérobie/anaérobie, incubation à 37 °C, lecture quotidienne, subculture pour identification et antibiogramme. - **Coptoculture** : recherche de pathogènes entériques, prélèvement de selles, inoculation sur milieux sélectifs (XLD, Hektoen, Skirrow, TCBS), incubation selon température et atmosphère, tests biochimiques (API 20E) ou moléculaires pour identification. - **Bactériologie du prélèvement cervico‑vaginal** : détection d’IST et de vaginites, écouvillon endocervical/vaginal, transport en Stuart/Amies, ensemencement sur chocolate agar (+ antibiotiques), Thayer‑Martin, Gardnerella, Sabouraud, incubation en CO₂ ou anaérobie, identification par oxydase, catalase, fermentations, MALDI‑TOF si disponible. - **Sécurité** : manipulation en BSL‑2, port de EPI, décontamination des surfaces, autoclave des déchets. - **Qualité** : respect des temps de transport, utilisation de milieux de contrôle positif et négatif, traçabilité des prélèvements (date, heure, numéro de lot). --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | **Hémoculture** | Technique de détection de micro-organismes dans le sang visant à diagnostiquer une bactériémie ou une fongémie. | | **Coptoculture** | Culture des selles permettant d’isoler les bactéries entériques pathogènes responsables de diarrées aiguës. | | **Milieu de transport Stuart** | Milieu semi‑solide préservant la viabilité des bactéries aérobies et anaérobies durant le transport vers le laboratoire. | | **Milieu de transport Amies** | Milieu similaire à Stuart, optimisé pour la préservation des gonocoques (*N. gonorrhoeae*). | | **Chocolate agar** | Gélose enrichie en facteurs V et X (hémolyse du sang) utilisée pour la culture de *Haemophilus* et *Neisseria*. | | **Thayer‑Martin** | Gélose sélective (chocolate agar + vancomycine, colistine, nystatine, triméthoprime) destinée à l’isolement de *N. gonorrhoeae*. | | **API 20E** | Bandelette de tests biochimiques permettant l’identification des entérobactéries et d’autres bactéries à métabolisme fermentatif. | | **MALDI‑TOF** | Méthode de spectrométrie de masse permettant l’identification rapide de micro-organismes à partir de leur profil protéique. | | **Oxydase** | Enzyme détectée par le test d’oxydase, positive chez *Neisseria*, *Pseudomonas* et quelques autres genres. | | **Catalase** | Enzyme qui dégrade le peroxyde d’hydrogène ; positive chez la plupart des staphylocoques et certaines bactéries aérobies. | | **Vaginose bactérienne** | Déséquilibre de la flore vaginale avec prédominance de *Gardnerella vaginalis* et augmentation du pH vaginal > 4,5. | | **Candidiase** | Infection causée par des levures du genre *Candida*, le plus souvent *C. albicans*, au niveau de la muqueuse vaginale. | | **BSL‑2** | Niveau de biosécurité 2, requis pour la manipulation d’agents pathogènes modérément dangereux (ex. : *Salmonella*, *N. gonorrhoeae*). | | **Antibiogramme** | Test de sensibilité aux antibiotiques réalisé par diffusion sur gélose pour déterminer le traitement approprié. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Calcul du volume de sang nécessaire pour une hémoculture **Consigne** : Un protocole d’hémoculture recommande un volume total de 20 ml de sang réparti équitablement entre deux flacons (aérobie et anaérobie). Le prélèvement est réalisé à l’aide d’une seringue de 5 ml. Combien de ponctions veineuses sont nécessaires ? **Corrigé** : - Volume total requis = 20 ml. - Volume par ponction = 5 ml (capacité de la seringue). - Nombre de ponctions = 20 ml ÷ 5 ml/ponction = **4 ponctions**. - Répartition : 2 ponctions pour le flacon aérobie (2 × 5 ml = 10 ml) et 2 ponctions pour le flacon anaérobie (idem). ### Exercice 2 – Interprétation d’un résultat de coptoculture **Consigne** : Un prélèvement de selles d’un enfant de 2 ans présentant une diarrhée aqueuse depuis 48 h est ensemencé sur XLD et Skirrow. Après 24 h d’incubation à 37 °C, on observe : - Sur XLD : colonies jaunes, diamètre 1–2 mm. - Sur Skirrow : aucune croissance. Le test d’oxydase sur une colonie XLD est négatif, tandis que la fermentation du glucose, du lactose et du saccharose est positive (production d’acide et de gaz). **Questions** : a) Quel est le genre bactérien le plus probable ? b) Quelle est l’espèce la plus fréquemment rencontrée dans ce profil ? c) Quel traitement empirique serait adapté en attendant la confirmation ? **Corrigé** : a) Le profil (colonies jaunes sur XLD, oxydase négative, fermentation du glucose, lactose, saccharose avec gaz) correspond à une entérobactérie lactose‑positive, typique du genre *Escherichia coli*. b) L’espèce la plus fréquemment rencontrée avec ce profil est *Escherichia coli* entérotoxinogène (ETEC) ou une souche commensale ; toutefois, en contexte diarrhéique aiguë, on suspecte davantage une *E. coli* productrice de toxine thermolabile (LT) ou thermostable (ST). c) En attendant la confirmation (PCR ou test de toxine), le traitement de première ligne est la réhydratation orale (solution de réhydratation orale – SRO) selon le degré de déshydratation. Un antibiotique n’est pas indiqué de façon empirique pour une diarrhée aqueuse non dysentérique chez l’enfant, sauf si apparaissent des signes de septicémie ou de dysenterie (sang dans les selles), auquel cas on pourrait envisager un antibiotique actif sur les *Shigella* (ex. : ciprofloxacine pédiatrique sous surveillance). --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | Situation | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de bonne pratique / Sécurité | |-----------|------------------|-------------|------------------------------------| | **Hémoculture** | Oublier de désinfecter le site de ponction avec deux antiseptiques successifs (alcool puis povidone‑iodée). | Augmentation du risque de contamination cutanée → faux‑positif (staphylocoques coagulase‑négatifs). | Toujours réaliser une double désinfection, laisser sécher complètement avant la ponction. | | **Hémoculture** | Inoculer moins de 3 ml de sang par flacon (volume insuffisant). | Diminution de la sensibilité → faux‑négatif, surtout en bactériémie à faible charge. | Respecter le volume recommandé (5 ml minimum par flacon) ; utiliser des pédiatriques adaptés si nécessaire. | | **Coptoculture** | Laisser les selles à température ambiante plus de 4 h avant inoculation. | Surcroissance de flore commensale masquant les pathogènes → résultats peu fiables. | Utiliser un milieu de transport (Cary‑Blair) si le délai dépasse 2 h, ou réfrigérer à 4 °C (max 24 h). | | **Coptoculture** | Incuber le milieu Skirrow à 37 °C au lieu de 42 °C sous microaérophilie. | Inhibition de la croissance de *Campylobacter* → faux‑négatif. | Respecter les conditions spécifiques : 42 °C, 5 % O₂, 10 % CO₂, 85 % N₂ (ou sachet microaérophile). | | **Prélèvement cervico‑vaginal** | Utiliser un écouvillon en coton ordinaire au lieu d’un écouvillon en rayon/algine. | Le coton retient des substances inhibitrices pouvant fausser la culture. | Toujours utiliser des écouvillons spécifiquement validés pour la microbiologie vaginale. | | **Prélèvement cervico‑vaginal** | Omettre de placer l’écouvillon immédiatement dans le milieu de transport. | Déshydratation de l’échantillon → perte de viabilité des bactéries fragiles (ex. : *N. gonorrhoeae*). | Transférer l’écouvillon dans le tube de transport dans les 30 s suivant le prélèvement. | | **Général** | Ne pas porter de gants ou de protection oculaire lors de la manipulation d’échantillons positifs. | Exposition du personnel à des agents pathogènes (risque d’infection professionnelle). | Porter systématiquement EPI (gants, blouse, lunettes, masque si risque d’aérosol). | | **Général** | Négliger la décontamination du plan de travail avec un désinfectant adéquat après chaque série de prélèvements. | Croissance croisée entre échantillons → contamination croisée. | Nettoyer la surface avec de l’alcool à 70 % ou une solution d’hypochlorite 0,1 % après chaque utilisation, laisser agir le temps de contact recommandé. | --- *Fin du cours.*