Introduction à la microbiologie (partie 1/3)

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de : 1. Définir la microbiologie et expliquer son champ d’application en santé, agroalimentaire et environnement au Cameroun. 2. Classer les principaux groupes de microorganismes et distinguer leurs caractéristiques morphologiques et métaboliques. 3. Préparer un milieu de culture adapté à un objectif donné (synthétique, complexe, sélectif, différentiel, d’enrichissement) en suivant les étapes de pesée, dissolution, stérilisation et ensemencement. 4. Appliquer les méthodes de stérilisation (chaleur humide, chaleur sèche, filtration, rayonnement) et de désinfection (alcool, hypochlorite, phénoliques) en respectant les paramètres critiques (température, pression, temps, concentration). 5. Mettre en œuvre les règles de sécurité et d’hygiène (EPI, gestion des déchets biologiques, étiquetage) lors de manipulations de milieux et de produits stérilisants. **Prérequis** : - Notions de biologie cellulaire (structure de la cellule procaryote/eucaryote). - Bases de chimie générale (solutions, concentrations, pH). - Connaissances élémentaires d’hygiène et de sécurité en laboratoire (port de blouse, gants, lunettes). --- ## Introduction contextualisée La microbiologie occupe une place centrale dans les secteurs stratégiques du Cameroun : santé publique (diagnostic des infections, contrôle de la qualité de l’eau), industrie agroalimentaire (fermentation, conservation, contrôle des pathogènes dans les produits laitiers et les boissons), et environnement (traitement des eaux usées, bioremédiation). Au lycée technique, les élèves doivent maîtriser les gestes de base du microbiologiste : préparer des milieux de culture stériles, observer les microorganismes au microscope, et appliquer des procédés de stérilisation et de désinfection conformes aux normes nationales (Arrêté n° 001/MINESEC du 12 janvier 2018 relatif à la sécurité des laboratoires scolaires). Ce chapitre constitue la première partie d’un tronc commun qui prépare aux épreuves pratiques du Baccalauréat séries F7. --- ## I. Introduction à la microbiologie ### A. Définition et champ d’application > **Définition** : La microbiologie est la science qui étudie les microorganismes, organismes unicellulaires ou acellulaires invisibles à l’œil nu, incluant bactéries, archées, champignons levuriformes, moisissures, protozoaires, virus et certaines algues. Son champ d’application s’étend à : - **Médecine** : diagnostic, vaccinothérapie, antibiothérapie. - **Industrie** : production d’enzymes, d’acides organiques, de biocarburants, de yaourts et de bière. - **Agriculture** : biofertilisants, biopesticides, ensilage. - **Environnement** : traitement des eaux, dégradation des polluants, cycles biogéochimiques. ### B. Jalons historiques - **XVIIᵉ siècle** : Antonie van Leeuwenhoek observe les « animalcules » avec un microscope à lentille simple. - **XIXᵉ siècle** : Louis Pasteur réfute la génération spontanée (expérience du col de cygne, 1860) et développe la pasteurisation. - **1882** : Robert Koch établit les postulats de Koch pour démontrer la causalité d’une maladie par un microorganisme (bacille de la tuberculose). - **1928** : Alexander Fleming découvre la pénicilline, inaugurant l’ère des antibiotiques. ### C. Classification des microorganismes | Groupe | Taille typique | Noyau | Paroi | Exemple pathogène | |--------|----------------|-------|-------|-------------------| | Bactéries | 0,5‑5 µm | Procaryote | Peptidoglycane | *Staphylococcus aureus* | | Archées | 0,5‑4 µm | Procaryote | Pseudopeptidoglycane | *Methanobacterium* (non pathogène) | | Champignons levuriformes | 3‑10 µm | Eucaryote | Glucanes, chitine | *Candida albicans* | | Moisissures | hyphes 2‑10 µm | Eucaryote | Chitine, glucanes | *Aspergillus niger* | | Protozoaires | 5‑200 µm | Eucaryote | Membrane plasmatique | *Giardia lamblia* | | Virus | 20‑300 nm | Acellulaire | Capside protéique | Virus de la grippe (Influenza) | | Algues microscopiques | 2‑100 µm | Eucaryote | Paroi cellulosique | *Chlorella vulgaris* | ### D. Méthodes d’observation 1. **Microscopie optique** : lumière transmise, grossissement 400‑1000×. 2. **Coloration de Gram** : différencie les bactéries à paroi épaisse (Gram‑positives, couleur violette) des parois fines (Gram‑négatives, couleur rose). 3. **Coloration spéciale** : Ziehl‑Neelsen pour les bacilles acido‑résistants (*Mycobacterium tuberculosis*), fluorescence pour marquage d’anticorps. ### E. Exemple d’atelier au lycée technique de Yaoundé - **Objectif** : préparer un smear de *Bacillus subtilis* sur lame, réaliser une coloration de Gram et observer au microscope. - **Matériel** : anses d’inoculation, lame propre, flamme de Bunsen, colorants (violet de cristal, iode, décolorant, safranine), microscope. - **Procédure** : 1. Stériliser l’anse au flamme, prélever une colonie, l’étaler en fine couche sur la lame. 2. Laisser sécher à l’air, fixer par passage rapide au flamme. 3. Appliquer le violet de cristal 1 min, rincer, ajouter l’iode de Lugol 1 min, rincer. 4. Décolorer avec l’alcool éthylique 95 % jusqu’à ce que le liquide soit clair (≈10 s). 5. Contraster avec la safranine 1 min, rincer, sécher à l’air. 6. Observer sous immersion huile (objectif 100×). - **Résultat attendu** : bâtonnets violets (Gram‑positif). --- ## II. Préparation des milieux de culture ### A. Définition > **Milieu de culture** : milieu nutritif solide ou liquide contenant les éléments nécessaires à la croissance et à la multiplication des microorganismes in vitro. ### B. Types de milieux | Type | Caractéristique | Exemple d’utilisation | |------|----------------|-----------------------| | Synthétique (défini) | Composition connue précisément (ex. : milieu M9) | Études métaboliques, génétique | | Complexe (indéfini) | Contient des extraits naturels (peptone, extrait de levure) | Isolement routinier, production | | Sélectif | Inhibe certains groupes, favorise d’autres (ex. : sel NaCl 7,5 % pour *Staphylococcus*) | Isolement de staphylocoques | | Différentiel | Permet de distinguer des colonies selon leur métabolisme (ex. : agar sang, MacConkey) | Identification de *E. coli* vs *Salmonella* | | D’enrichissement | Favorise la croissance d’un microorganisme présent en faible nombre (ex. : milieu Selenite cystine pour *Salmonella*) | Préenrichissement avant isolement | ### C. Composants principaux - **Source de carbone** : glucose, lactose, sucrose. - **Source d’azote** : peptone, extrait de levure, caséine hydrolysée. - **Facteurs de croissance** : vitamines, acides aminés, facteurs de purine/pyrimidine. - **Tampon de pH** : phosphate (Na₂HPO₄/KH₂PO₄) pour maintenir pH ≈ 7,0‑7,5. - **Agent gélifiant** : agar‑agar (polysaccharide provenant d’algues rouges) ; concentration typique 15 g/L pour milieu solide. - **Additifs sélectifs/différentiels** : sels biliaires, cristal violet, neutral red, indicateur de fermentation (phénol rouge). ### D. Calcul de la quantité d’agar‑agar Pour obtenir un milieu solide à 15 g/L : \[ \text{Masse d’agar (g)} = 15 \times \frac{V_{\text{milieu (L)}}}{1} \] Exemple : pour 500 mL (0,5 L) → \(15 \times 0,5 = 7,5\) g d’agar‑agar. ### E. Procédé pas à pas (préparation d’un milieu nutritif solide) 1. **Pesée** : peser précisément chaque composant sur une balance analytique (précision 0,01 g). 2. **Dissolution** : verser les solutés dans un bécher contenant environ 80 % du volume d’eau distillée finale, chauffer sous agitation jusqu’à dissolution complète. 3. **Ajustement du volume** : compléter avec de l’eau distillée jusqu’au volume marqué (ex. : 500 mL). 4. **Contrôle du pH** : mesurer avec un pH‑mètre, corriger si nécessaire avec NaOH 1 N ou HCl 1 N. 5. **Stérilisation** : placer le milieu dans un flacon ou une bouteille à vis, autoclaver à 121 °C, 15 psi pendant 15 min. 6. **Refroidissement** : laisser tiédir à 45‑50 °C (éviter la gélification prématurée). 7. **Mise en plaques** : verser 15‑20 mL de milieu dans chaque boîte de Pétri stérile, laisser solidifier à température ambiante. 8. **Ensemençage** : réaliser un étalement (streak) ou un point d’inoculation avec une anse stérile. ### F. Exemple chiffré : préparation de 500 mL de milieu nutritif (type « NB ») | Composant | Concentration souhaitée | Masse pour 500 mL | |-----------|------------------------|-------------------| | Peptone | 5 g/L | \(5 \times 0,5 = 2,5\) g | | Extrait de levure | 3 g/L | \(3 \times 0,5 = 1,5\) g | | Chlorure de sodium (NaCl) | 5 g/L | \(5 \times 0,5 = 2,5\) g | | Agar‑agar | 15 g/L | \(15 \times 0,5 = 7,5\) g | | Eau distillée | q.s. à 500 mL | — | **Étapes** : peser 2,5 g peptone, 1,5 g extrait de levure, 2,5 g NaCl, 7,5 g agar‑agar ; dissoudre dans 400 mL d’eau chaude ; porter à ébullition ; ajuster le volume à 500 mL ; vérifier pH ≈ 7,0 ; autoclaver 15 min à 121 °C ; refroidir à 45 °C ; verser dans boîtes de Pétri. ### G. Tableau récapitulatif des milieux courants au laboratoire scolaire | Milieu | Type | Utilisation principale | Composition clé (g/L) | |--------|------|------------------------|-----------------------| | Nutrient Broth (NB) | Complexe liquide | Culture générale, prélèvements | Peptone 5, Extrait de levure 3, NaCl 5 | | Nutrient Agar (NA) | Complexe solide | Isolement sur plaque | NB + Agar‑agar 15 | | Mannitol Salt Agar (MSA) | Sélectif & différentiel | Détection de *Staphylococcus aureus* | Peptone 10, Extrait de levure 1, NaCl 75, Mannitol 10, Phénol rouge 0,025, Agar‑agar 15 | | MacConkey Agar | Sélectif & différentiel | Isolation des entérobactéries lactose+ / lactose‑ | Peptone 20, Extrait de levure 5, Lactose 10, Sels biliaires 5, Neutral red 0,04, Cristal violet 0,001, Agar‑agar 15 | | Sabouraud Dextrose Agar (SDA) | Sélectif pour champignons | Culture de levures et moisissures | Dextrose 20, Peptone 10, Agar‑agar 15 | | MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) | Sélectif pour lactobacilles | Isolement de *Lactobacillus* | Glucose 20, Peptone 10, Extrait de levure 5, Acétate de sodium 5, Tween 80 1, MgSO₄·7H₂O 0,2, MnSO₄·H₂O 0,05, K₂HPO₄ 2, Agar‑agar 15 (si solide) | --- ## III. Stérilisation et désinfection ### A. Définitions > **Stérilisation** : procédé visant à détruire ou éliminer toutes formes de vie microbienne (y compris les spores) sur un objet ou dans un milieu. > **Désinfection** : réduction du nombre de microorganismes pathogènes à un niveau jugé sûr, mais ne garantissant pas l’élimination des spores. > **Antisepsie** : application d’un agent désinfectant sur des tissus vivants. ### B. Méthodes de stérilisation | Méthode | Principe | Paramètres typiques | Avantages / Limites | |---------|----------|---------------------|---------------------| | Chaleur humide (autoclave) | Dénaturation des protéines par vapeur saturée | 121 °C, 15 psi, 15‑20 min (ou 134 °C, 30 psi, 3‑4 min pour prions) | Très efficace, pénétrante ; nécessite équipement, pas adapté aux thermolabiles | | Chaleur sèche (étuve) | Oxydation et dénaturation par air chaud | 160‑180 °C, 1‑2 h | Bon pour verrerie, poudres ; moins pénétrant que vapeur | | Filtration | Rétention physique sur membrane | Pore 0,22 µm (bactéries) ou 0,1 µm (mycoplasmes) | Adapté aux liquides thermosensibles ; ne retire pas les virus très petits | | Rayonnement UV‑C | Lésion de l’ADN par formation de dimères thymine‑thymine | 254 nm, dose ≈ 2‑5 mJ/cm² (surfaces) | Rapide, sans résidu ; portée limitée, ombre portée | | Agents gazeux (oxyde d’éthylène) | Alkylation des groupes fonctionnels | 30‑60 °C, 0,5‑1 mg/L, 2‑6 h, sous vide | Pénétrant, utilisé pour matériels thermolabiles ; toxique, nécessite aération | | Agents liquides (glutaraldéhyde 2 %) | Croix‑liaison des protéines | 20‑25 °C, 10‑30 min (immersion) | Efficace sur endoscopes ; corrosif, nécessite rinçage | ### C. Paramètres critiques de l’autoclave (chaleur humide) - **Température** : 121 °C (point d’ébullition de l’eau sous 1 atm de surpression). - **Pression** : 15 psi (≈ 1,03 bar au‑delà de la pression atmosphérique). - **Temps** : 15 min pour les liquides ≤ 100 mL ; 20‑30 min pour volumes > 500 mL ou charges denses. - **Valeur F0** (unité de létalité thermique) : \[ F_0 = \int_{0}^{t} 10^{\frac{T(t)-121}{z}} \, dt \] où *z* ≈ 10 °C pour la plupart des spores. En pratique, on considère que 121 °C pendant 15 min donne F0 = 15. ### D. Exemple de calcul simplifié de F0 Un cycle d’autoclave à 121 °C pendant 20 min : \[ F_0 = 20 \times 10^{\frac{121-121}{10}} = 20 \times 10^{0} = 20 \] Ainsi, le cycle fournit une létalité équivalente à 20 min à 121 °C. ### E. Méthodes de désinfection courantes | Agent | Concentration d’usage | Temps de contact | Microorganismes cibles | Précautions | |-------|----------------------|------------------|------------------------|-------------| | Alcool éthylique 70 % v/v | 70 % | 30 s‑1 min | Bactéries végétatives, virus enveloppés | Inflammable, ne pas utiliser sur spores | | Hypochlorite de sodium (eau de Javel) 0,5 % actif | 0,5 % Cl₂ actif | 5‑10 min | Bactéries, virus, spores (à concentration supérieure) | Corrosif, dégagement de chlore, porter lunettes et gants | | Phénoliques (ex. : lysol) | 0,5‑1 % | 5‑10 min | Bactéries, champignons, virus non enveloppés | Toxique, éviter inhalation | | Iodophores (povidone‑iodine) | 10 % iode disponible | 30 s‑1 min | Bactéries, virus, champignons | Peut tacher, éviter sur tissus sensibles | | Peroxyde d’hydrogène 3 % | 3 % | 5‑10 min | Bactéries, virus, spores (à concentration plus élevée) | Décompose en eau et O₂, mais peut endommager certains matériaux | ### F. Règles de sécurité et d’hygiène en laboratoire de microbiologie > **Règle 1** : Toujours porter une blouse de laboratoire, des gants nitrile et des lunettes de protection lors de la manipulation de milieux non stériles ou de produits chimiques. > **Règle 2** : Désinfecter le plan de travail avec un désinfectant approprié (ex. : alcool 70 % ou hypochlorite 0,5 %) avant et après chaque séance. > **Règle 3** : Utiliser un brûleur Bunsen ou une lampe à alcool pour créer une zone de travail stérile (flamme) lors des ensemencements. > **Règle 4** : Éliminer les déchets biologiques (plaques usées, pipettes contaminées) dans des contenants rigides marqués « Déchets biologiques » et les faire incinérer selon la réglementation nationale (Arrêté n° 003/MINSANTE du 15 mars 2020). > **Règle 5** : Ne jamais pipetter à la bouche ; utiliser exclusivement des pipettes à embout filtrant ou des pipettes mécaniques. > **Règle 6** : Vérifier l’intégrité des autoclaves (manomètre, indicateur biologique type *Bacillus stearothermophilus* spores) avant chaque cycle. ### G. Exemple professionnel : désinfection d’un poste de travail dans une brasserie artisanale à Douala - **Contexte** : contrôle qualité de la fermentation, prélèvement d’échantillons de moût. - **Produit choisi** : solution d’hypochlorite de sodium à 0,2 % Cl₂ actif (préparée en diluant 1 mL d’eau de Javel 5 % dans 24 mL d’eau distillée). - **Procédé** : 1. Nettoyer les surfaces avec un détergent neutre, rincer à l’eau distillée. 2. Appliquer l’hypochlorite à l’aide d’un spray non abrasif, laisser agir 10 min. 3. Rincer abondamment à l’eau stérile (filtrée 0,22 µm) pour éliminer les résidus de chlore. 4. Sécher avec un chiffon non pelucheux ou laisser sécher à l’air. - **Contrôle** : réaliser un test de swab sur la surface, ensemencer sur gélose nutritive, incuber 24 h à 37 °C ; absence de croissance confirme une désinfection efficace. --- ## Synthèse du chapitre - **Microbiologie** : étude des microorganismes (bactéries, virus, champignons, protozoaires, algues). - **Histoire** : Leeuwenhoek → Pasteur (pasteurisation, réfutation de la génération spontanée) → Koch (postulats) → Fleming (pénicilline). - **Classification** : taille, nature du noyau, présence de paroi, exemples pathogènes. - **Observation** : microscopie optique, coloration de Gram, colorations spécialisées. - **Milieux de culture** : définition, types (synthétique, complexe, sélectif, différentiel, d’enrichissement), composants (carbone, azote, facteurs de croissance, tampon, agar‑agar). - **Préparation** : pesée, dissolution, ajustement du volume, contrôle du pH, stérilisation (autoclave 121 °C, 15 psi, 15‑20 min), mise en plaques, ensemencement. - **Exemple de calcul** : préparation de 500 mL de milieu nutritif (peptone 5 g/L, extrait de levure 3 g/L, NaCl 5 g/L, agar‑agar 15 g/L). - **Stérilisation** : chaleur humide (autoclave), chaleur sèche, filtration, rayonnement UV, agents gazeux/liquides ; paramètres critiques (T, P, t, F0). - **Désinfection** : alcool 70 %, hypochlorite 0,5 %, phénoliques, iodophores, peroxyde d’hydrogène ; temps de contact et précautions. - **Sécurité** : EPI, désinfection des plans de travail, zone de stérilité (flamme), gestion des déchets biologiques, interdiction de pipetage à la bouche, contrôle des autoclaves. - **Application professionnelle** : préparation de milieux dans un lycée technique, désinfection d’un poste de travail en brasserie. --- ## Glossaire > **Agar‑agar** : polysaccharide extrait d’algues rouges, utilisé comme agent gélifiant à 15 g/L pour obtenir un milieu solide. > **Autoclave** : appareil de stérilisation par chaleur vapeur saturée (121 °C, 15 psi). > **Coloration de Gram** : technique de différenciation des bactéries en fonction de l’épaisseur de leur paroi peptidoglycanique. > **Milieu sélectif** : milieu contenant un inhibiteur qui permet la croissance seulement de certains groupes de microorganismes. > **Postulats de Koch** : quatre critères établissant un lien de causalité entre un microorganisme et une maladie. > **Stérilisation** : procédé visant à détruire toutes formes de vie microbienne, y compris les spores. > **Valeur F0** : unité de létalité thermique exprimée en minutes équivalentes à 121 °C, utilisée pour comparer l’efficacité des cycles de stérilisation. > **Zone de stérilité** : espace de travail créé par la flamme d’un brûleur Bunsen où les courants d’air ascendants empêchent la contamination par des particules aériennes. --- ## Exercices d’applications corrigés ### Exercice 1 – Préparation d’un milieu sélectif **Consigne** : Vous devez préparer 250 mL de milieu MRS solide (agar‑agar 15 g/L) destiné à l’isolement de lactobacilles provenant d’un produit laitier traditionnel. Calculer les masses de chaque composant à peser. **Données** : - Glucose : 20 g/L - Peptone : 10 g/L - Extrait de levure : 5 g/L - Acétate de sodium : 5 g/L - Tween 80 : 1 % v/v (considéré comme 1 g/100 mL) - MgSO₄·7H₂O : 0,2 g/L - MnSO₄·H₂O : 0,05 g/L - K₂HPO₄ : 2 g/L - Agar‑agar : 15 g/L **Corrigé** Pour 250 mL (0,25 L) : | Composant | Concentration (g/L) | Masse pour 0,25 L (g) | |-----------|--------------------|-----------------------| | Glucose | 20 | 20 × 0,25 = **5,0** | | Peptone | 10 | 10 × 0,25 = **2,5** | | Extrait de levure | 5 | 5 × 0,25 = **1,25** | | Acétate de sodium | 5 | 5 × 0,25 = **1,25** | | Tween 80 | 1 % v/v → 10 g/L | 10 × 0,25 = **2,5** (soit 2,5 mL) | | MgSO₄·7H₂O| 0,2 | 0,2 × 0,25 = **0,05** | | MnSO₄·H₂O | 0,05 | 0,05 × 0,25 = **0,0125** ≈ **0,01** | | K₂HPO₄ | 2 | 2 × 0,25 = **0,5** | | Agar‑agar | 15 | 15 × 0,25 = **3,75** | **Procédure** : peser les solides, dissoudre dans 200 mL d’eau chaude, ajouter le Tween 80 (2,5 mL) sous agitation, porter à ébullition, ajuster le volume à 250 mL, vérifier le pH (≈ 6,2), autoclaver 15 min à 121 °C, refroidir à 45 °C, verser dans boîtes de Pétri, ensemencer avec 100 µL de suspension de produit laitier, incuber 48 h à 30 °C. --- ### Exercice 2 – Détermination du temps d’autoclave **Consigne** : Un lot de 2 L de milieu nutritif liquide doit être stérilisé. L’autoclave de l’établissement atteint 121 °C et 15 psi. Quelle durée minimale doit-on appliquer pour garantir une stérilisation efficace, sachant que la charge est constituée de milieux contenant des protéines pouvant protéger les spores ? **Données** : - Volume : 2 L (charge importante). - Référence : pour un volume ≤ 100 mL, 15 min à 121 °C suffit. - Facteur de correction : ajouter 5 min pour chaque tranche de 500 mL au‑delà de 100 mL (recommandation courante en milieu scolaire). **Corrigé** Volume au‑delà de 100 mL : 2 L − 0,1 L = 1,9 L = 1900 mL. Nombre de tranches de 500 mL : 1900 / 500 = 3,8 → on arrondit à **4** tranches (on ne sous‑estime jamais). Temps additionnel : 4 × 5 min = 20 min. Temps de base : 15 min. **Temps total recommandé** : 15 + 20 = **35 min**. On pourra également placer un indicateur biologique (spores de *Bacillus stearothermophilus*) au centre du lot pour valider le cycle. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | # | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |---|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Oublier de flamer l’anse avant chaque prélèvement | Contamination croisée, résultats faux | Toujours flamer l’anse au brûleur avant et après chaque prise d’échantillon ; laisser refroidir quelques secondes avant d’entrer en contact avec le milieu. | | 2 | Utiliser de l’eau du robinet pour préparer les milieux | Introduction de minéraux, de chlore ou de microorganismes pouvant inhiber la croissance | Utiliser exclusivement de l’eau distillée ou déionisée, préalablement vérifiée (conductivité < 5 µS/cm). | | 3 | Régler l’autoclave à une température inférieure à 121 °C (ex. : 100 °C) | Survie des spores, stérilisation inefficace | Vérifier le manomètre et le thermomètre avant chaque cycle ; ne jamais démarrer un cycle si la pression ne atteint pas 15 psi. | | 4 | Verser le milieu chaud (> 55 °C) directement sur les boîtes de Pétri | Formation de condensation, risque de brûlure, gélification non homogène | Laisser tiédir le milieu à 45‑50 °C avant le versement ; utiliser un support résistant à la chaleur. | | 5 | Négliger le port de lunettes lors de la manipulation d’hypochlorite de sodium | Risque de projection oculaire, irritation sévère | Toujours porter des lunettes de protection anti‑projections ; en cas de contact, rincer immédiatement à l’eau abondante pendant 15 min et consulter un infirmier. | | 6 | Réutiliser une lame de microscope sans nettoyage approprié | Artefacts de observation, contamination des préparations suivantes | Nettoyer la lame avec de l’alcool 70 %, flamer légèrement, puis essuyer avec un papier non pelucheux avant chaque nouvelle préparation. | --- *Fin du cours.*