Analyses bactériologiques des liquides biologiques (partie 2/2)

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de : 1. Réaliser une centrifugation adaptée aux liquides biologiques en choisissant la vitesse et le temps appropriés. 2. Effectuer un étalement stérile sur gélose et interpréter les colonies obtenues. 3. Appliquer la coloration de Gram sur un prélèvement liquide et lire le résultat au microscope. 4. Ensemencer différents liquides biologiques (urine, liquide céphalorachidien, pleural, peritoneal) sur des milieux sélectifs et différentiels. 5. Réaliser l’analyse bactériologique des crachats : préparation, coloration, culture et identification des principaux pathogènes respiratoires. 6. Appliquer les règles d’hygiène, de biosécurité et de gestion des déchets liés aux manipulations de liquides biologiques. **Prérequis** : - Connaissances de base en microbiologie générale (bactéries, champignons, virus). - Maîtrise des règles d’asepsie et de manipulation du matériel de laboratoire (pipettes, lames, porte‑objet). - Notions de métrique (ml, µl, g, cm) et de calcul de pourcentage. - Utilisation du microscope optique à lumière blanche (objectifs 10×, 40×, 100× immersion). --- ## Introduction contextualisée Dans les laboratoires d’analyse médicale du Cameroun, les liquides biologiques (urine, LCR, liquides de ponction, crachats) constituent des échantillons privilégiés pour diagnostiquer les infections bactériennes. La rapidité et la fiabilité des résultats dépendent de la bonne exécution des étapes de pré‑traitement (centrifugation, étalement) et de coloration (Gram) avant la mise en culture. Ce chapitre présente, de façon progressive, les gestes techniques indispensables pour obtenir un diagnostic bactériologique fiable, en respectant les normes de sécurité du ministère de la Santé publique et les référentiels du MINESEC/IGE. --- ## I. Centrifugation, étalement et coloration au Gram des liquides biologiques ### A. Principe de la centrifugation La centrifugation permet de concentrer les éléments cellulaires (bactéries, leucocytes, cellules épithéliales) présents en faible nombre dans un liquide biologique. Le facteur clé est le **facteur de centrifugation relatif (RCF)**, exprimé en *g* (accélération gravitationnelle). > **RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × r (cm) × (N)²** > où *r* est le rayon du rotor (distance du tube au centre de rotation) et *N* la vitesse en tours par minute (rpm). Exemple chiffré : un rotor de rayon *r* = 10 cm, vitesse *N* = 3000 rpm. RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × 10 × (3000)² RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × 10 × 9 000 000 RCF ≈ 1 006 g Ainsi, à 3000 rpm on obtient environ 1 000 g, suffisante pour précipiter la plupart des bactéries dans les urines ou le LCR. ### B. Protocole d’étalement 1. **Préparation du poste de travail** : désinfection du plan avec 70 % d’éthanol, port de gants, blouse et lunettes de protection. 2. **Mise en suspension** : après centrifugation, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette stérile, laisser un dépôt de ≈ 100 µl au fond du tube. 3. **Re‑suspension** : vortexer doucement 5 s pour homogénéiser le dépôt. 4. **Étalement** : déposer 10 µl de suspension sur la surface d’une gélose préalablement séchée (gélose sanguine, gélose chocolat ou milieu sélectif selon le liquide). À l’aide d’une boucle d’inoculation flammée, réaliser des stries en quadrillage (méthode de streaking) pour isoler des colonies individuelles. 5. **Incubation** : placer les boîtes à 35‑37 °C en atmosphère ambiante (ou 5 % CO₂ pour certains milieux) pendant 18‑24 h. > **Règle de sécurité** : jamais de pipettage à la bouche ; utiliser exclusivement des pipettes à embout filtré ou des pipettes mécaniques. ### C. Coloration de Gram La coloration de Gram différencie les bactéries à paroi épaisse (Gram‑positives) de celles à paroi fine (Gram‑négatives). | Étape | Réactif | Temps d’action | Observation au microscope | |-------|---------|----------------|---------------------------| | 1. Fixation | Chaleur légère (flamme) ou méthanol | 1 s | Fixation des cellules sur la lame | | 2. Colorant primaire | Violet de cristal | 1 min | Toutes les cellules deviennent violettes | | 3. Mordant | Iode de Lugol | 1 min | Complexe violet‑iode formé | | 4. Décoloration | Éthanol‑acétone (50 %/50 %) | 10‑20 s (selon épaisseur du dépôt) | Les Gram‑négatives perdent la couleur, les Gram‑positives restent violettes | | 5. Contrastage | Safranine ou fuchsine de base | 45 s | Les Gram‑négatives prennent une couleur rose/rouge | | 6. Rinçage & séchage | Eau distillée, séchage à l’air | – | Lame prête à l’observation | > **À retenir** : la décoloration est l’étape critique ; un temps trop long décolore aussi les Gram‑positives, un temps trop court laisse les Gram‑négatives violettes. **Lecture** : sous immersion d’huile (objectif 100×), observer la forme (cocci, bacilles) et la couleur. Noter : - Gram‑positifs : cocci en grappes (*Staphylococcus*), chaînes (*Streptococcus*), bacilles (*Bacillus*, *Clostridium*). - Gram‑négatifs : cocci (*Neisseria*, *Moraxella*), bacilles (*Enterobacteriaceae*, *Pseudomonas*, *Haemophilus*). --- ## II. Culture des liquides biologiques et analyses bactériologiques des crachats ### A. Préparation des milieux de culture | Milieu | Utilisation principale | Composition clé | Conditions d’incubation | |--------|-----------------------|-----------------|--------------------------| | Gélose sanguine (5 % sang defibriné) | Isolement général, hémolyse | Peptone, extrait de levure, NaCl, agar, sang | 35‑37 °C, atmosphère ambiante | | Gélose chocolat (sang chauffé) | Pathogènes fastidieux (*Haemophilus*, *Neisseria*) | Même base que gélose sanguine + chauffage du sang à 80 °C | 35‑37 °C, 5 % CO₂ | | Milieu de Lowenstein‑Jensen | *Mycobacterium tuberculosis* | Asparagine, malachite verte, glycérine, jaune d’œuf | 37 °C, 5‑8 % CO₂, 3‑6 semaines | | Gélose MacConkey | Entérobactéries (lactose +/‑) | Peptone, lactose, sels biliaires, cristal violet, neutral red, agar | 35‑37 °C, atmosphère ambiante | | Gélose mannitol salée | *Staphylococcus aureus* | Mannitol, NaCl 7,5 %, agar, rouge de phénol | 35‑37 °C, atmosphère ambiante | > **À retenir** : la stérilisation des milieux se fait par autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 15 min. ### B. Ensemencement des liquides biologiques 1. **Urine** : après centrifugation (3000 rpm, 5 min, RCF≈1000 g), re‑suspension du dépôt dans 100 µl de sérum physiologique. Ensemencer 10 µl sur gélose sanguine et MacConkey (méthode de streaking). Incuber 18‑24 h. 2. **Liquide céphalorachidien (LCR)** : centrifugation à 4000 rpm, 10 min (RCF≈1800 g). Déposer 10 µl sur gélose chocolat et sanguine. Incuber en CO₂. 3. **Liquide de ponction pleurale/péritonéale** : même procédé que LCR, mais ajouter un milieu sélectif pour anaérobies (gélose avec hémine et vitamine K) si suspicion d’infection mixte. 4. **Crachats** : pas de centrifugation (risque de perte de pathogènes intracellulaires). Homogénéiser le crachat avec un volume égal de solution de sputolysine (dithiothréitol 0,1 %) pendant 15 min à 37 °C, puis ensemencer 10 µl sur gélose sanguine, chocolat et MacConkey. > **À retenir** : le volume d’ensemencement standard est de 10 µl pour obtenir des colonies comptables (30‑300 UFC/plaque). ### C. Analyse bactériologique des crachats 1. **Microscopie directe** : réaliser une coloration de Gram sur une fine étalage de crachat préalablement traité avec sputolysine. Rechercher : - *Streptococcus pneumoniae* (cocci à diplocoques, Gram‑positif). - *Haemophilus influenzae* (cocco‑bacilles, Gram‑négatif). - *Staphylococcus aureus* (cocci en grappes, Gram‑positif). - *Mycobacterium tuberculosis* (bacilles acido‑résistants, nécessite coloration de Ziehl‑Neelsen). 2. **Culture** : comme décrit en B. Incuber les boîtes en atmosphère appropriée. 3. **Identification** : - Test de catalase (positif pour *Staphylococcus*, négatif pour *Streptococcus*). - Test de coagulase (positif pour *S. aureus*). - Test d’oxydase (positif pour *Pseudomonas*, *Neisseria*). - Fermentation du lactose sur MacConkey (rose = lactose +). - Pour les bacilles acido‑résistants, confirmation par test de niacinémie ou PCR si disponible. > **À retenir** : la présence de plus de 25 cellules épithéliales squameuses par champ à faible puissance indique un crachat de mauvaise qualité (contamination salivaire) et nécessite un nouvel échantillon. --- ## Synthèse du chapitre - **Centrifugation** : choisir RCF selon le liquide (urine ≈ 1000 g, LCR ≈ 1800 g) ; formule RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × r × N². - **Étalement** : re‑suspension du dépôt, ensemencement de 10 µl, streaking pour isoler des colonies. - **Coloration de Gram** : séquence fixe‑colorant‑mordant‑décoloration‑contrastage ; décoloration critique (10‑20 s). - **Milieux de culture** : gélose sanguine (général), chocolat (fastidieux), MacConkey (entérobactéries), Lowenstein‑Jensen (TB), mannitol salée (Staph). - **Ensemencement des liquides** : urine et LCR après centrifugation ; crachats après sputolysine ; volume 10 µl. - **Analyse des crachats** : microscopie Gram, culture, tests biochimiques (catalase, coagulase, oxydase, lactose). - **Sécurité** : port de EPI, autoclave des déchets, interdiction du pipettage buccal, décontamination des surfaces à l’éthanol 70 %. --- ## Glossaire - **RCF** : Relative Centrifugal Force, facteur de centrifugation exprimé en *g*. - **Sputolysine** : solution de dithiothréitol utilisée pour liquéfier les crachats avant analyse. - **Streaking** : technique d’étalement en stries pour isoler des colonies bactériennes. - **UFC** : Unité Formant Colonie, mesure du nombre de bactéries viables dans un échantillon. - **Gélose chocolat** : milieu enrichi par chauffage du sang, favorisant la croissance de *Haemophilus* et *Neisseria*. - **Catalase** : enzyme qui décompose le peroxyde d’hydrogène ; test permettant de différencier *Staphylococcus* (positif) de *Streptococcus* (négatif). - **Coagulase** : enzyme qui fait coaguler le plasma ; marqueur de *Staphylococcus aureus*. - **Oxydase** : enzyme de la chaîne respiratoire ; test positif pour *Pseudomonas*, *Neisseria*. --- ## Exercices d’applications corrigés ### Exercice 1 – Calcul du RCF Un technicien doit centrifuger un échantillon d’urine dans un rayon de rotor 9,5 cm à 2500 rpm. Calculer le RCF obtenu et dire s’il est adapté pour précipiter les bactéries (seuil ≈ 800 g). **Corrigé** : RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × 9,5 × (2500)² RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × 9,5 × 6 250 000 RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × 59 375 000 RCF ≈ 664 g Le RCF obtenu (≈ 660 g) est légèrement inférieur au seuil de 800 g recommandé pour les urines ; il faudrait augmenter la vitesse à environ 3000 rpm (RCF≈1000 g) ; augmenter le temps de centrifugation à 2500 rpm n'augmente pas le RCF et n'améliore pas sensiblement la récupération si la force est insuffisante. ### Exercice 2 – Dénombrement d’UFC dans un liquide céphalorachidien Après centrifugation d’un LCR (4000 rpm, 10 min), le dépôt est re‑suspendu dans 100 µl de sérum physiologique. 10 µl de cette suspension sont étalés sur gélose sanguine. Après incubation, 42 colonies sont dénombrées. Calculer la concentration bactérienne initiale du LCR en UFC/ml. **Corrigé** : Facteur de dilution = volume total de re‑suspension / volume ensemencé = 100 µl / 10 µl = 10. Nombre d’UFC dans l’ensemencement = 42 colonies. UFC dans la suspension = 42 × 10 = 420 UFC dans 100 µl. Conversion en UFC/ml : 420 UFC / 0,1 ml = 4 200 UFC/ml. La concentration initiale du LCR est donc d’environ **4,2 × 10³ UFC/ml**. ### Exercice 3 – Interprétation d’une coloration de Gram Sur une lame de crachat colorée au Gram, on observe : des cocci à diplocoques violets, des bacilles fins roses et quelques levures violettes. Quelle est l’interprétation préliminaire ? **Corrigé** : - Cocci à diplocoques violets → **Gram‑positifs**, suggestive de *Streptococcus pneumoniae*. - Bacilles fins roses → **Gram‑négatifs**, pouvant être *Haemophilus influenzae* ou une entérobactérie. - Levures violettes → présence de champignons levuriformes (ex. *Candida albicans*), pouvant indiquer une colonisation ou une infection fongique secondaire. Il convient de réaliser une culture sur gélose chocolat et sanguine ainsi qu’un test de catalase pour confirmer l’identité des cocci, et un test d’oxydase pour les bacilles. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | Situation | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de bonne pratique / sécurité | |-----------|------------------|-------------|------------------------------------| | 1. Centrifugation | Utiliser un tube non équilibré dans le rotor | Vibration, risque de rupture du tube et projection de liquide contaminé | Toujours équilibrer les tubes à masse égale (±0,1 g) ; utiliser des adaptateurs si nécessaire. | | 2. Étalement | Ré‑utiliser une boucle d’inoculation sans la reflammer entre deux stries | Contamination croisée, faux‑positifs | Flammer la boucle jusqu’à rouge vif après chaque passage ; laisser refroidir quelques secondes avant de reprendre l’ensemencement. | | 3. Coloration de Gram | Laisser le décolorant agir trop longtemps (ex. 60 s) | Décoloration excessive des Gram‑positifs → résultat faussement Gram‑négatif | Respecter le temps de décoloration (10‑20 s) ; contrôler avec un témoin connu (ex. *Staphylococcus aureus* Gram‑positif, *Escherichia coli* Gram‑négatif). | | 4. Ensemencement des crachats | Oublier l’étape de sputolysine et centrifuger le crachat | Perte des bactéries intracellulaires, sous‑estimation de la charge pathogène | Toujours liquéfier le crachat avec sputolysine (ou équivalent) avant toute manipulation ; ne pas centrifuger sauf indication particulière (ex. recherche de mycobactéries). | | 5. Gestion des déchets | Jeter les lames utilisées dans la poubelle ordinaire | Risque de perforation et d’exposition aux agents pathogènes | Déposer les objets tranchants (lames, aiguilles) dans un conteneur rigide réservé aux déchets perforants, puis autoclaver avant élimination finale. | | 6. Incubation | Ouvrir l’incubateur fréquemment pour vérifier la croissance | Variations de température et d’humidité, inhibition de certains organismes | Limiter les ouvertures ; utiliser un témoin de croissance (ex. bandelette de contrôle) placé à l’intérieur de l’incubateur pour surveiller les conditions sans ouvrir la porte. | --- *Fin du cours.*