Hémoculture (partie 1/2)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - choisir le milieu de culture adapté à une hémoculture en fonction du contexte clinique et des microorganismes suspectés ; - préparer les milieux selon les bonnes pratiques de laboratoire (stérilité, pH, température) ; - réaliser l’ensemencement du sang dans les conditions de sécurité requises ; - surveiller la croissance, isoler les colonies et effectuer un antibiogramme conforme aux recommandations du CA‑SFM ; - appliquer les règles d’hygiène, de biosécurité et de traçabilité propres à l’hémoculture. **Prérequis :** - connaissances de base en bactériologie (Gram, aérobie/anaérobie, exigences nutritionnelles) ; - maîtrise des techniques de stérilisation (autoclave, filtration) ; - notions de manipulation sécuritaire des échantillons biologiques (EPI, gestion des déchets) ; - utilisation du lecteur de résultats d’antibiogramme (zone d’inhibition, critères CA‑SFM). --- ## Introduction contextualisée L’hémoculture demeure l’examen de référence pour détecter une bactériémie ou une fongémie, notamment chez les patients présentant de la fièvre d’origine inconnue, un choc septique ou une endocardite suspectée. Au Cameroun, les laboratoires de biologie médicale des hôpitaux de référence (Hôpital Général de Yaoundé, Hôpital Laquintinie de Douala) réalisent quotidiennement des hémocultures afin d’orienter l’antibiothérapie empirique et de réduire la morbidité liée aux sepsis. La qualité du résultat dépend étroitement du choix du milieu, de la préparation préalable, du volume de sang ensemencé et du respect des protocoles de sécurité. Ce cours présente, en deux leçons, les étapes essentielles depuis la sélection des milieux jusqu’à la réalisation de l’antibiogramme, en s’appuyant sur des situations professionnelles réalistes rencontrées dans les laboratoires camerounais. --- ## I. Leçon 21 : Choix des milieux et préparation des conditions d’hémoculture ### A. Principes de l’hémoculture L’hémoculture consiste à incuber un volume de sang dans un milieu liquide riche en nutriments, favorisant la multiplication des microorganismes présents dans le sang. La détection précoce de la croissance permet d’initier un traitement adapté et d’éviter les complications sévères. > *Milieu de culture hémoculture : milieu liquide stérile, généralement enrichi en facteurs de croissance (hémine, vitamine K) et contenant un agent anticoagulant (souvent du SPS – sodium polyanethol sulfonate) pour neutraliser les facteurs inhibiteurs du sang.* ### B. Critères de choix des milieux 1. **Type de microorganisme suspecté** : - Bactéries aérobies et facultativement anaérobies → milieu **Bouillon Trypticase Soy (BTS)** ou **Bouillon Brain Heart Infusion (BHI)**. - Bactéries strictement anaérobies → milieu **Bouillon thioglycolate** ou **Bouillon anaérobie spécial (ex. : CDC anaérobie)**. - Levures et champignons → milieu **Bouillon Sabouraud** ou **Bouillon mycologique (ex. : MYCO F Lytic)**. 2. **Volume de sang recommandé** : 8‑10 mL par flacon pour un adulte, 1‑2 mL pour un nourrisson (ratio sang/milieu généralement 1:5 à 1:10). 3. **Présence d’anticorps ou de facteurs inhibiteurs** : ajout de SPS ou de résine pour neutraliser le complément et les antibiotiques éventuels. 4. **Stabilité et durée d’incubation** : milieux permettant une incubation de 5 à 7 jours à 35‑37 °C sous atmosphère appropriée (aérobie, anaérobie ou CO₂ enrichie). ### C. Préparation des milieux (exemple de procédure) | Étape | Action | Détails techniques | Contrôle qualité | |-------|--------|--------------------|------------------| | 1 | Réhydratation du milieu poudre | Dissoudre 30 g de BTS dans 1 L d’eau distillée stérile | Vérifier la dissolution complète, pas de grumeaux | | 2 | Ajustement du pH | Ajuster à 7,3 ± 0,2 à l’aide de NaOH 1 N ou HCl 1 N | Mesurer avec pH-mètre étalonné | | 3 | Filtration stérile | Passer à travers un filtre 0,22 µm (ou autoclave 121 °C 15 min) | Test de stérilité (incubation 48 h à 35 °C, pas de turbidité) | | 4 | Ajout des suppléments | Ajouter SPS à 0,05 % (w/v) et hémine 5 µg/mL si nécessaire | Vérifier la concentration par spectrophotométrie (si disponible) | | 5 | Distribution | Répartir 45 mL de milieu dans des flacons stériles de 50 mL (ou système BACTEC) | Peser chaque flacon : 45 ± 0,5 g | | 6 | Étiquetage | Indiquer : milieu, date de préparation, numéro de lot, date de péremption (max 14 jours) | Vérifier lisibilité et conformité aux BPF | > *Stérilité du milieu : absence de croissance après incubation de 48 h à 35 °C en milieu liquide clair.* ### D. Conditions d’incubation - **Température** : 35‑37 °C (optimal pour la plupart des pathogènes sanguins). - **Atmosphère** : - Flacons aérobies : atmosphère ambiante (5 % CO₂ autorisée). - Flacons anaérobies : sachet anaérobie ou générateur de CO₂/H₂ (ex. : Gaspak). - **Durée** : surveillance quotidienne pendant les 3 premiers jours, puis contrôle tous les 24 h jusqu’au jour 7. - **Agitation** : légère (pour les systèmes automatisés) ou statique (flacons classiques) afin d’assurer une bonne oxygénation sans hémolyse excessive. ### E. Sécurité et hygiène - Port obligatoire de gants nitrile, blouse, lunettes de protection et masque facial lors de la manipulation du sang. - Utilisation d’une boîte de sécurité biologique de niveau 2 (BSL‑2) pour l’ouverture des flacons et l’ensemencement. - Décontamination des surfaces avec une solution d’hypochlorite à 0,5 % après chaque manipulation. - Élimination des déchets sanguins dans des conteneurs destinés aux déchets infectieux (code couleur jaune). > *Règle de biosécurité : tout échantillon de sang est considéré comme potentiellement pathogène ; manipulation exclusivement en BSL‑2.* --- ## II. Leçon 22 : Ensemencement, isolement et antibiogramme en hémoculture ### A. Prélèvement du sang et volume recommandé - **Site** : veine périphérique (coudé) après désinfection cutanée à l’alcool 70 % suivi d’une teinture à l’iode povidone (10 %) laissé sécher 30 s. - **Volume** : - Adulte : 2 flacons de 8‑10 mL chacun (un aérobie, un anaérobie) → total 16‑20 mL. - Enfant (>1 mois) : 1 mL d’âge en années, jusqu’à un maximum de 5 mL par flacon. - Nouveau‑né : 0,5‑1 mL par flacon. - **Ratio sang/milieu** : idéalement 1:5 à 1:10 pour éviter la dilution excessive des facteurs de croissance tout en neutralisant les inhibiteurs. > *Volume minimal significatif : 1 mL de sang dans 5 mL de milieu permet la détection d’une concentration de 1 ufc/mL (unité formant colonie par millilitre).* ### B. Ensemencement des milieux 1. **Méthode directe** : injection du volume de sang prélevé dans le flacon contenant le milieu préalablement préparé (sans dilution). 2. **Méthode de dilution** (utilisée lorsqu’on travaille avec des systèmes automatisés type BACTEC) : mélange préalable du sang avec un tampon de dilution (ex. : solution saline stérile) à raison de 1:1 avant ajout au flacon. - **Technique** : réaliser l’ensemencement sous hotte à flux laminaire ou dans une boîte de sécurité BSL‑2, en utilisant une seringue stérile de 5‑10 mL, en évitant les bulles d’air. - **Contrôle** : vérifier l’intégrité du bouchon et l’absence de fuite après l’ensemencement. ### C. Incubation et surveillance - Placer les flacons dans l’incubateur à 35‑37 °C, atmosphère appropriée. - Lecture quotidienne : recherche de turbidité, de gaz (production de CO₂ détectée par indicateur de pH ou capteur BACTEC), de sédimentation ou de floculation. - En cas de signal positif, réaliser un **subculture** immédiat sur milieux solides (agar sang, agar chocolat, agar MacConkey) pour isolement. ### D. Isolement des colonies - Étaler 10 µL du milieu positif sur chaque plaque d’agrément choisi, en utilisant une boucle stérile. - Incuber les plaques : - Agar sang et chocolat : 35‑37 °C, 5 % CO₂, 24‑48 h. - Agar MacConkey : 35‑37 °C, aérobie, 18‑24 h. - Observer la morphologie (forme, couleur, hémolyse) et réaliser des tests biochimiques rapides (catalase, oxydase, coagulase, API strips) ou utiliser un système d’identification automatisé (VITEK, MALDI‑TOF). > *Critère d’isolement réussi : obtention de colonies isolées permettant la réalisation d’au moins trois tests biochimiques distincts.* ### E. Réalisation de l’antibiogramme 1. **Préparation de la suspension bactérienne** : ajuster la turbidité à un équivalent de 0,5 McFarland (~1,5 × 10⁸ ufc/mL) dans du sérum physiologique stérile. 2. **Ensemencement sur agar Mueller‑Hinton** : utiliser un swab stérile pour recouvrir uniformément la surface de la plaque. 3. **Application des disques antibiotiques** : placer les disques selon la norme CA‑SFM (ex. : amoxicilline‑clavulanate 20/10 µg, céftriaxone 30 µg, vancomycine 30 µg, métronidazole 5 µg pour anaérobies, etc.). 4. **Incubation** : 35‑37 °C, 16‑20 h. 5. **Lecture** : mesurer le diamètre de la zone d’inhibition (en mm) à l’aide d’un réglet ou d’un appelant numérique. 6. **Interprétation** : comparer aux seuils CA‑SFM (S = sensible, I = intermédiaire, R = résistant). > *Zone d’inhibition : diamètre mesuré autour d’un disque antibiotique, indicateur de l’activité du médicament sur la souche testée.* ### F. Contrôle de qualité et traçabilité - Inclure un témoin de qualité (souche ATCC 25923 *Staphylococcus aureus* ou ATCC 29213 *Escherichia coli*) à chaque série d’antibiogrammes. - Enregistrer dans le LIMS (Laboratory Information Management System) : numéro d’échantillon, date/heure de prélèvement, milieux utilisés, résultats de croissance, identification, antibiogramme, nom du technicien, validation du biologiste. - Conserver les flacons positifs pendant 7 jours après incubation pour éventuelles analyses complémentaires (PCR, sérologie). > *Traçabilité : chaque étape doit être enregistrée de façon lisible, indélébile et accessible pour audit interne ou externe.* --- ## Synthèse du chapitre - **Choix du milieu** : fonction du microorganisme suspecté (aérobie, anaérobie, levure) et du volume de sang (8‑10 mL/adulte). - **Préparation** : réhydratation, ajustement du pH à 7,3, filtration stérile (0,22 µm) ou autoclave, ajout de SPS, répartition et étiquetage. - **Incubation** : 35‑37 °C, atmosphère adaptée, surveillance quotidienne jusqu’à J+7. - **Ensemencement** : volume de sang respectant le ratio 1:5‑1:10, réalisé en BSL‑2, sans bulles d’air. - **Détection** : turbidité, gaz, sédimentation → subculture immédiate sur milieux solides. - **Isolement** : colonies isolées sur agar sang, chocolat, MacConkey ; identification biochimique ou MALDI‑TOF. - **Antibiogramme** : suspension 0,5 McFarland sur Mueller‑Hinton, disques CA‑SFM, lecture des zones d’inhibition, interprétation selon seuils. - **Qualité & sécurité** : témoins de qualité, EPI, BSL‑2, gestion des déchets, traçabilité LIMS. --- ## Glossaire - **Hémoculture** : culture du sang dans un milieu liquide destiné à détecter la présence de microorganismes pathogènes. - **Milieu BTS (Trypticase Soy Bouillon)** : milieu liquide riche en peptones et glucides, utilisé pour la culture des bactéries aérobies et facultativement anaérobies. - **SPS (Sodium polyanethol sulfonate)** : agent anticoagulant ajouté aux milieux d’hémoculture pour neutraliser les facteurs inhibiteurs du sang. - **McFarland 0,5** : standard de turbidité correspondant à environ 1,5 × 10⁸ ufc/mL, utilisé pour ajuster la suspension bactérienne avant antibiogramme. - **Zone d’inhibition** : diamètre mesuré autour d’un disque antibiotique sur agar, indicateur de la sensibilité ou de la résistance d’une souche. - **BSL‑2 (Biosafety Level 2)** : niveau de confinement adapté à la manipulation d’agents pathogènes modérés, tel que le sang humain. - **CA‑SFM** : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, éditeur des recommandations d’interprétation des antibiogrammes en France et utilisées dans de nombreux laboratoires africains. - **LIMS** : Système de gestion de l’information de laboratoire, permettant l’enregistrement, le suivi et la restitution des résultats d’analyses. --- ## Exercices d'application corrigés **Exercice 1** Un patient de 68 ans admis aux urgences présente une fièvre à 39,5 °C depuis 24 h. Le médecin prescrit deux hémocultures (aérobie et anaérobie). Vous disposez de flacons contenant 45 mL de milieu BTS chacun. 1. Calculer le volume total de sang à prélever pour respecter le ratio sang/milieu de 1:8. 2. Déterminer le volume de milieu qui restera non utilisé après l’ensemencement, sachant que chaque flacon reçoit la même quantité de sang. **Corrigé** 1. Ratio 1:8 signifie 1 partie de sang pour 8 parties de milieu. Volume de milieu par flacon = 45 mL. Volume de sang par flacon = 45 mL ÷ 8 = 5,625 mL. Volume total de sang = 2 × 5,625 mL = 11,25 mL. On prélevera donc **≈ 11,3 mL** de sang (on peut réaliser deux prélèvements de 5,6 mL chacun, en ajustant légèrement si nécessaire). 2. Volume de milieu utilisé = volume de sang × 8 = 5,625 mL × 8 = 45 mL par flacon. Milieu restant par flacon = 45,0 mL – 45,0 mL = 0 mL. Pour deux flacons : 0 mL × 2 = **0 mL** de milieu non utilisé. Ainsi, aucun milieu ne reste non utilisé lorsque le prélèvement respecte exactement le ratio 1:8. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | N° | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |----|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Prélèvement de sang avec un volume insuffisant (< 5 mL/adulte) | Faible sensibilité, risque de faux‑négatif | Respecter le volume recommandé (8‑10 mL/adulte) et vérifier le ratio sang/milieu avant l’ensemencement. | | 2 | Oublier d’ajouter le SPS au milieu | Inhibition de la croissance par le complément sanguin → faux‑négatif | Toujours contrôler la présence de SPS (vérifier la fiche technique du milieu) avant la stérilisation finale. | | 3 | Réaliser l’ensemencement en dehors d’une hotte ou d’une BSL‑2 | Exposition du personnel à des agents pathogènes, risque d’infection | Effectuer toute manipulation du sang sous hotte à flux laminaire ou dans une boîte de sécurité BSL‑2, porter EPI complet. | | 4 | Utiliser un milieu périmé ou non stérilisé | Contamination du milieu, croissance de flore environnementale → résultats inexploitables | Vérifier la date de péremption et réaliser un test de stérilité (incubation 48 h à 35 °C) avant chaque utilisation. | | 5 | Lire les zones d’inhibition avec un réglet non calibré | Erreur d’interprétation de l’antibiogramme (S/I/R faux) | Utiliser un réglet ou un appelant numérique calibré annuellement ; réaliser un contrôle qualité avec souches ATCC à chaque série. | | 6 | Ne pas éliminer correctement les déchets sanguins | Risque de contamination croisée et d’infection du personnel | Déposer les déchets dans des conteneurs jaunes destinés aux déchets infectieux, fermer hermétiquement et les faire collecter par le service d’hygiène hospitalière. | --- *Fin du cours.*