CHIMIE ANALYTIQUE INSTRUMENTALE (partie 4/5)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Expliquer les principes de la chromatographie et décrire le fonctionnement d’un analyseur automatique d’hématologie. - Réaliser une analyse chromatographique simple (TLC ou HPLC) et interpréter un chromatogramme obtenu sur un analyseur d’hématologie. - Définir résistance, résistivité, conductance et conductivité, établir les relations entre ces grandeurs et les unités associées. - Mesurer la conductivité d’une solution aqueuse avec une cellule de conductimétrie, appliquer la correction de température et utiliser la loi de Kohlrausch. - Mettre en œuvre un protocole de titrage conductimétrique pour suivre une réaction acido‑basique ou doser un électrolyte. - Appliquer les règles de sécurité et d’hygiène propres aux manipulations de réactifs chimiques, de sang et d’appareils électriques. **Prérequis :** - Notions de base en chimie générale (solutions, électrolytes, pH). - Connaissances en électricité (loi d’Ohm, puissance). - Manipulation de verrerie de laboratoire et lecture de consignes de sécurité (pictogrammes GHS). --- ## Introduction contextualisée Dans les laboratoires d’analyse médicale et de contrôle qualité au Cameroun, la chimie analytique instrumentale permet d’obtenir des résultats rapides, fiables et reproductibles. Deux familles de techniques sont particulièrement utilisées : les méthodes de séparation (chromatographie) pour identifier et quantifier des composés dans des matrices complexes (sang, urines, eau de boisson) et les méthodes conductimétriques pour suivre la variation de la charge électrique d’une solution lors d’une réaction ou pour contrôler la pureté de l’eau potable. Ce chapitre présente, sous forme de travaux dirigés (TD), les principes théoriques, les procédés opératoires et les aspects de sécurité liés à ces techniques, en s’appuyant sur des situations professionnelles rencontrées dans les centres de santé, les usines de traitement d’eau et les laboratoires de recherche du MINESEC/IGE. --- ## I. Leçon 17 : Analyse chromatographique et analyseur automatique d’hématologie ### A. Principes de la chromatographie La chromatographie sépare les constituants d’un mélange en fonction de leurs affinités respectives pour une phase stationnaire et une phase mobile. Le facteur de rétention \(R_f\) (pour TLC) ou le temps de rétention \(t_R\) (pour HPLC/GC) caractérise chaque composé : \[ R_f = \frac{d_{\text{composé}}}{d_{\text{solvant}}} \qquad t_R = t_0 + k' \, t_0 \] où \(t_0\) est le temps mort (non retenu) et \(k'\) le facteur de capacité. > **Définition :** La phase stationnaire peut être solide (silice, alumina) ou liquide immobilisée sur un support ; la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants adapté à la polarité des analytes. ### B. Types de chromatographie utilisés en laboratoire | Technique | Phase stationnaire | Phase mobile | Application typique au Cameroun | |-----------|-------------------|--------------|---------------------------------| | Chromatographie sur papier (PC) | Papier cellulose | Solvant organique/aquatique | Détection de pigments végétaux, contrôle de qualité des tisanes | | Chromatographie en couche mince (TLC) | Silice G sur plaque aluminium | Solvant (ex. hexane/éthylacétate) | Analyse de résidus de pesticides dans les céréales | | HPLC (phase inverse) | C18 lié à silice | Mélange eau/acétonitrile avec modificateur pH | Dosage de médicaments (paracétamol, antibiotiques) dans le plasma | | GC (gaz) | Colonne capillaire polymère | Gaz porteur (hélium, azote) | Analyse de composés volatils (alcools, solvants) dans l’air de travail | Dans le cadre de l’hématologie, l’HPLC est souvent couplée à un détecteur UV ou à un détecteur de masse pour identifier les hémoglobines variantes (HbS, HbC). ### C. Analyseur automatique d’hématologie Les analyseurs modernes mesurent, par principe d’impédance électrique (Coulter) ou de diffusion de lumière (flow cytometry), les paramètres suivants : - **Hémoglobine (Hb)** – méthode colorimétrique (cyanméthémoglobine) - **Hématocrite (Hct)** – calculé à partir du volume globulaire moyen (VGM) et du nombre de globules rouges (RBC) - **Numération globulaire blanche (WBC)** – différenciation par fluorescence ou diffraction de lumière - **Numération globulaire rouge (RBC)** – comptage par impédance - **Plaquettes (PLT)** – détection par impédance haute fréquence Le principe d’impédance repose sur la mesure de la variation de résistance lorsqu’une cellule traverse un orifice soumis à un courant constant : \[ \Delta V = I \, \Delta R \quad\text{avec}\quad \Delta R = \rho \frac{L}{A_{\text{cellule}}} \] où \(\rho\) est la résistivité du milieu, \(L\) la longueur du trajet et \(A_{\text{cellule}}\) la section effective de la cellule. > **Principe :** Chaque particule provoquant un changement de volume électrique génère un pulse dont l’amplitude est proportionnelle à son volume et dont la fréquence donne le nombre de particules. ### D. TD : protocole d’analyse d’un échantillon sanguin 1. **Préparation** : prélever 20 µL de sang total dans un tube EDTA, mélanger doucement. 2. **Mise en marche** : vérifier que l’analyseur est en mode “Warm‑up” terminé (température stabilisée à 20 °C ± 0,5 °C). 3. **Calibration** : exécuter le contrôle de qualité (niveau bas, moyen, haut) fourni par le fabricant ; accepter si les résultats sont dans les intervalles de confiance définis par le fabricant (souvent ± 2 % pour les paramètres principaux). 4. **Analyse** : aspirer l’échantillon, lancer le cycle (environ 60 s). 5. **Lecture des résultats** : noter Hb (g/dL), Hct (%), WBC (×10⁹/L), RBC (×10¹²/L), PLT (×10⁹/L). 6. **Interprétation** : comparer aux valeurs de référence camerounaises (ex. Hb homme 13,5‑17,5 g/dL, femme 12,0‑15,5 g/dL). 7. **Entretien** : nettoyer la cuve d’échantillon avec solution de nettoyage, rincer à l’eau distillée, sécher à l’air. **Sécurité** : porter des gants nitrile, une blouse et des lunettes de protection ; manipuler le sang comme un matériau biologique de risque groupe 2 (décontamination avec 0,5 % d’hypochlorite). --- ## II. Leçon 18 : Conductimétrie : résistance, résistivité, conductance, conductivité ### A. Définitions et relations fondamentales - **Résistance** \(R\) (ohm, \(\Omega\)) : opposition au passage du courant continu. - **Résistivité** \(\rho\) (ohm·mètre, \(\Omega\cdot m\)) : propriété intrinsèque du matériau. - **Conductance** \(G\) (siemens, S) : inverse de la résistance. - **Conductivité** \(\kappa\) (siemens/mètre, S·m⁻¹) : inverse de la résistivité. Relations géométriques pour un conducteur de longueur \(L\) et de section transversale \(A\) : \[ R = \rho \frac{L}{A} \qquad G = \frac{1}{R} = \frac{1}{\rho}\frac{A}{L} \qquad \kappa = \frac{1}{\rho} = G \frac{L}{A} \] > **Formule clé :** \(\displaystyle \kappa = G \frac{L}{A}\) (conductivité à partir de la conductance mesurée et de la constante de cellule \(K = L/A\)). ### B. Unités et conversions | Grandeur | Symbole | Unité SI | Équivalence pratique | |----------|---------|----------|----------------------| | Résistance | \(R\) | \(\Omega\) | 1 kΩ = 10³ Ω | | Résistivité | \(\rho\) | \(\Omega\cdot m\) | eau ultrapure ≈ 18,2 MΩ·cm | | Conductance | \(G\) | S | 1 mS = 10⁻³ S | | Conductivité | \(\kappa\) | S·m⁻¹ | eau de boisson ≈ 0,05‑0,5 S·m⁻¹ | ### C. Mesure de la conductivité d’une solution Une cellule de conductimétrie comporte deux électrodes plates séparées par une distance connue \(L\) et présentant une surface \(A\). La conductance mesurée \(G\) permet d’obtenir \(\kappa\) après correction de température : \[ \kappa_T = \kappa_{25}\,\bigl[1 + \alpha (T-25)\bigr] \] où \(\alpha\) est le coefficient de température moyen (≈ 0,02 °C⁻¹ pour les solutions aqueuses de sels forts). > **Règle de correction :** Pour chaque degré Celsius au‑dessus de 25 °C, augmenter la conductivité mesurée de 2 % (solution NaCl 0,1 M). ### D. Applications professionnelles - **Contrôle de la qualité de l’eau potable** : mesure de la conductivité globale pour détecter la présence d’ions dissous (chlorures, nitrates, sulfates). - **Suivi des réactions acido‑basiques** : la conductivité varie linéairement avec la concentration des espèces ioniques produites ou consommées. - **Dosage d’électrolytes** (Na⁺, K⁺, Cl⁻) dans les sérums physiologiques ou les solutions de perfusion. - **Détection de fuites** dans les systèmes de refroidissement industriel (variation brusque de \(\kappa\)). ### E. Normes de sécurité et d’hygiène - Utiliser des gants en nitrile lorsqu’on manipule des solutions concentrées d’acides ou de bases. - Éviter les courts‑circuits : les électrodes de la cellule doivent être immergées uniquement dans la solution, jamais en contact avec le boîtier métallique de l’appareil. - Après chaque mesure, rincer la cellule à l’eau distillée puis sécher à l’air pour éviter la cristallisation de sels qui altérerait la constante de cellule. - En cas de débordement de solution acide, neutraliser immédiatement avec une solution de bicarbonate de soude (5 % m/v) puis rincer abondamment. --- ## III. Leçon 19 : TD sur la conductimétrie ### A. Objectif du travail pratique Déterminer la conductivité de solutions aqueuses de NaCl à différentes concentrations et vérifier la loi de Kohlrausch : \[ \Lambda_m = \Lambda_m^0 - K \sqrt{c} \] où \(\Lambda_m = \kappa / c\) est la conductivité molaire, \(\Lambda_m^0\) la conductivité molaire à dilution infinie et \(K\) une constante dépendant du solvant et de la température. ### B. Protocole pas à pas | Étape | Action | Détails | |------|--------|---------| | 1 | Préparer une solution mère de NaCl 1,00 M | Peser 58,44 g de NaCl pur, dissoudre dans 1 L d’eau distillée. | | 2 | Réaliser des dilutions successives | Préparer 0,10 M, 0,050 M, 0,020 M, 0,010 M, 0,005 M en utilisant des pipettes volumétriques de classe A. | | 3 | Rincer et remplir la cellule de conductimétrie | Rincer trois fois avec chaque solution avant la mesure. | | 4 | Mesurer la conductance \(G\) à 25 °C | Utiliser un conductimètre réglé sur la plage appropriée (ex. 0‑200 mS). Noter la valeur. | | 5 | Calculer la conductivité \(\kappa\) | Appliquer \(\kappa = G \times K\) où la constante de cellule \(K\) a été déterminée préalablement avec une solution KCl 0,01 M (valeur fournie par le fabricant, ex. \(K = 0,500\ \text{cm}^{-1}\)). | | 6 | Déterminer \(\Lambda_m = \kappa / c\) | \(c\) en mol·L⁻¹, \(\kappa\) en S·m⁻¹ → convertir en S·cm²·mol⁻¹ si besoin. | | 7 | Tracer \(\Lambda_m\) en fonction de \(\sqrt{c}\) | Ajuster une droite linéaire ; l’ordonnée à l’origine donne \(\Lambda_m^0\), la pente \(-K\). | | 8 | Comparer avec les valeurs littérature (NaCl à 25 °C : \(\Lambda_m^0 ≈ 126,4\ \text{S·cm}^2\text{·mol}^{-1}\)) | Évaluer l’erreur relative. | ### C. Exemple chiffré entièrement résolu **Données** : - Constante de cellule \(K = 0,500\ \text{cm}^{-1}\) (déterminée avec KCl 0,01 M). - Mesure de conductance pour une solution NaCl 0,010 M : \(G = 1,25\ \text{mS} = 1,25\times10^{-3}\ \text{S}\). **Calcul de la conductivité** : \[ \kappa = G \times K = (1,25\times10^{-3}\ \text{S}) \times (0,500\ \text{cm}^{-1}) = 6,25\times10^{-4}\ \text{S·cm}^{-1} \] Conversion en S·m⁻¹ (1 S·cm⁻¹ = 100 S·m⁻¹) : \[ \kappa = 6,25\times10^{-4}\ \times 100 = 6,25\times10^{-2}\ \text{S·m}^{-1} \] **Conductivité molaire** : \[ c = 0,010\ \text{mol·L}^{-1}=0,010\ \text{mol·dm}^{-3}=10\ \text{mol·m}^{-3} \] \[ \Lambda_m = \frac{\kappa}{c}= \frac{6,25\times10^{-2}\ \text{S·m}^{-1}}{10\ \text{mol·m}^{-3}} = 6,25\times10^{-3}\ \text{S·m}^{2}\text{·mol}^{-1} \] Conversion en S·cm²·mol⁻¹ (1 S·m² = 10⁴ S·cm²) : \[ \Lambda_m = 6,25\times10^{-3}\times10^{4}=62,5\ \text{S·cm}^{2}\text{·mol}^{-1} \] **Résultat** : \(\Lambda_m = 62,5\ \text{S·cm}^{2}\text{·mol}^{-1}\) pour 0,010 M NaCl à 25 °C. En répétant pour les autres concentrations et en tracant \(\Lambda_m\) vs \(\sqrt{c}\), on obtient une pente approximative de \(-20\ \text{S·cm}^{2}\text{·mol}^{-1}\text{·M}^{-1/2}\) et une ordonnée à l’origine de \(126\ \text{S·cm}^{2}\text{·mol}^{-1}\), conforme aux valeurs de référence. > **Loi de Kohlrausch (limite de dilution infinie)** : \(\displaystyle \Lambda_m^0 = \lim_{c\to 0}\Lambda_m\). ### D. Interprétation et contrôle de qualité - La linéarité du graphique confirme que la solution se comporte comme un électrolyte fort entièrement dissocié. - Un écart significatif de la pente indique une association d’ions ou une impureté (ex. présence de Ca²⁺ qui forme des paires d’ions). - La constance de la cellule doit être revérifiée chaque semaine avec une solution étalon KCl 0,01 M (conductivité théorique 1,413 mS·cm⁻¹ à 25 °C). --- ## Synthèse du chapitre - **Chromatographie** : séparation basée sur les affinités phase stationnaire / phase mobile ; \(R_f\) ou \(t_R\) permettent l’identification ; HPLC couplé à un détecteur UV/MS utilisé pour l’hématologie (détection d’hémoglobines variantes). - **Analyseur automatique d’hématologie** : mesure d’impédance ou de diffusion de lumière ; paramètres clés : Hb, Hct, WBC, RBC, PLT ; entretien quotidien, contrôle de qualité, précautions biologiques. - **Conductimétrie** : relations \(R=\rho L/A\), \(G=1/R\), \(\kappa = G L/A\) ; unité S·m⁻¹ ; correction de température \(\kappa_T = \kappa_{25}[1+\alpha(T-25)]\). - **Applications** : contrôle qualité de l’eau, suivi de réactions acido‑basiques, dosage d’électrolytes, détection de fuites. - **TD de conductimétrie** : préparation d’étalons NaCl, mesure de conductance, calcul de \(\kappa\) et \(\Lambda_m\), vérification de la loi de Kohlrausch, détermination de \(\Lambda_m^0\) et de la constante \(K\). - **Sécurité** : gants nitrile, lunettes, blouse ; éviter courts‑circuits ; décontamination des débordements acides/bases ; entretien régulier des cellules. --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | **Chromatographie** | Technique de séparation des constituants d’un mélange en fonction de leur répartition entre une phase stationnaire et une phase mobile. | | **Phase stationnaire** | Matériau fixe (solide ou liquide immobilisé) qui interagit avec les analytes lors de la séparation. | | **Phase mobile** | Solvant ou mélange de solvants qui entraîne les analytes à travers la phase stationnaire. | | **Temps de rétention (\(t_R\))** | Intervalle entre l’injection de l’échantillon et la détection d’un composé donné en chromatographie. | | **Facteur de rétention (\(R_f\))** | Rapport de la distance parcourue par un composé à celle parcourue par le solvant en TLC. | | **Analyseur d’hématologie** | Appareil automatisé qui mesure, par impédance ou cytométrie en flux, les paramètres hématologiques (Hb, Hct, WBC, RBC, PLT). | | **Impédance électrique** | Opposition d’un milieu au passage d’un courant alternatif, dépendant de la résistivité et de la géométrie du trajet. | | **Résistivité (\(\rho\))** | Propriété intrinsèque d’un matériau quantifiant sa résistance à l’écoulement du courant, unité \(\Omega\cdot m\). | | **Conductance (\(G\))** | Inverse de la mesure de la résistance, unité siemens (S). | | **Conductivité (\(\kappa\))** | Inverse de la résistivité, mesure de la capacité d’un milieu à conduire le courant électrique, unité S·m⁻¹. | | **Constante de cellule (\(K\))** | Rapport \(L/A\) d’une cellule de conductimétrie, déterminée expérimentalement avec une solution étalon. | | **Loi de Kohlrausch** | Relation linéaire entre la conductivité molaire \(\Lambda_m\) et la racine de la concentration \(\sqrt{c}\) pour les électrolytes forts à dilution modérée. | | **Conductivité molaire (\(\Lambda_m\))** | Rapport \(\kappa/c\), exprimée en S·cm²·mol⁻¹, caractérisant la capacité conductrice d’une mole d’ions dans une solution. | | **Contrôle de qualité (QC)** | Procédure visant à vérifier la justesse et la précision d’un appareil d’analyse à l’aide de solutions étalon de concentrations connues. | | **Décontamination** | Processus d’élimination ou d’inactivation des agents biologiques dangereux (sang, liquides organiques) par des agents chimiques (hypochlorite, alcool). | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Chromatographie sur couche mince (TLC) Un technicien de laboratoire analyse un extrait de plante médicinale pour détecter la présence de flavonoïdes. Il dépose 2 µL d’extrait sur une plaque TLC silice, utilise comme phase mobile un mélange toluène : acétate d’éthyle (7 : 3 v/v). Après révélation sous UV (254 nm), il observe deux taches : - Tache A : \(R_f = 0,32\) - Tache B : \(R_f = 0,58\) Les références connues donnent : flavonoïde X \(R_f = 0,30\pm0,02\), flavonoïde Y \(R_f = 0,55\pm0,02\). **Question** : Identifier les taches A et B et justifier votre réponse. **Corrigé** : - Tache A : \(R_f = 0,32\) se situe dans l’intervalle \([0,28;0,34]\) du flavonoïde X → il s’agit très probablement du flavonoïde X. - Tache B : \(R_f = 0,58\) est légèrement au‑dessus de l’intervalle \([0,53;0,57]\) du flavonoïde Y mais encore compatible compte tenu de l’erreur expérimentale typique (±0,03). On peut donc attribuer la tache B au flavonoïde Y, en notant qu’un léger décalage peut provenir d’une variation de l’humidité de la plaque ou de la température de la chambre de développement. --- ### Exercice 2 – Conductimétrie – détermination de la constante de cellule Une cellule de conductimétrie est plongée dans une solution étalon de KCl 0,01 M à 25 °C. La conductivité théorique de cette solution est \(\kappa_{th}=1,413\ \text{mS·cm}^{-1}\). La conductance mesurée est \(G=0,706\ \text{mS}\). **Question** : Calculer la constante de cellule \(K\) de cette cellule. **Corrigé** : \[ K = \frac{\kappa_{th}}{G}= \frac{1,413\ \text{mS·cm}^{-1}}{0,706\ \text{mS}} = 2,00\ \text{cm}^{-1} \] La constante de cellule vaut donc \(K = 2,00\ \text{cm}^{-1}\). --- ### Exercice 3 – Titrage conductimétrique d’un acide fort avec une base forte On veut déterminer la concentration d’une solution d’HCl inconnue par titrage conductimétrique avec une solution de NaOH 0,100 M. Le volume initial d’HCl est 25,0 mL. On enregistre la conductivité du mélange après chaque ajout de 0,5 mL de NaOH. Les valeurs suivantes (en µS·cm⁻¹) sont obtenues : | V\(_{NaOH}\) (mL) | \(\kappa\) (µS·cm⁻¹) | |-------------------|----------------------| | 0,0 | 420 | | 0,5 | 380 | | 1,0 | 340 | | 1,5 | 300 | | 2,0 | 260 | | 2,5 | 220 | | 3,0 | 180 | | 3,5 | 140 | | 4,0 | 100 | | 4,5 | 60 | | 5,0 | 20 | | 5,5 | 10 | | 6,0 | 5 | | 6,5 | 2 | | 7,0 | 1 | La conductivité de l’eau pure à 25 °C est \(\kappa_{eau}=0,055\ \mu S·cm^{-1}\) (négligeable). **Question** : Déterminer le volume d’équivalence \(V_{eq}\) et la concentration de l’HCl. **Corrigé** : Le titre montre une décroissance linéaire de la conductivité jusqu’à une forte chute près de 5,0 mL de NaOH, puis un plateau très bas correspondant à l’excès de base. Le volume d’équivalence se situe au point où la pente change brusquement : entre 4,5 mL (60 µS·cm⁻¹) et 5,0 mL (20 µS·cm⁻¹). On peut prendre \(V_{eq}=4,8\ \text{mL}\) (interpolation linéaire). Le nombre de moles de NaOH ajouté à l’équivalence : \[ n_{NaOH}= C_{NaOH}\times V_{eq}=0,100\ \text{mol·L}^{-1}\times 4,8\times10^{-3}\ \text{L}=4,8\times10^{-4}\ \text{mol} \] Comme la réaction est HCl + NaOH → NaCl + H₂O, \(n_{HCl}=n_{NaOH}=4,8\times10^{-4}\ \text{mol}\). Concentration de l’HCl : \[ C_{HCl}= \frac{n_{HCl}}{V_{HCl}}= \frac{4,8\times10^{-4}\ \text{mol}}{25,0\times10^{-3}\ \text{L}}=1,92\times10^{-2}\ \text{mol·L}^{-1}=0,0192\ \text{M} \] Ainsi, la solution d’HCl inconnue a une concentration d’environ **0,019 M**. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | N° | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |----|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Oublier de rincer la cuve d’échantillon de l’analyseur d’hématologie entre deux patients | Carry‑over → résultat faux (ex. surestimation des globules blancs) | Rincer systématiquement avec la solution de nettoyage du fabricant, puis avec de l’eau distillée, sécher à l’air. | | 2 | Utiliser une pipette non calibrée pour préparer les étalons de conductimétrie | Erreur systématique sur toutes les concentrations → mauvaise pente de la loi de Kohlrausch | Vérifier la calibration des pipettes volumétriques chaque mois ; utiliser des pipettes de classe A pour les travaux quantitatifs. | | 3 | Mesurer la conductivité d’une solution chaude sans appliquer la correction de température | Surestimation de \(\kappa\) (ex. +2 % par °C au‑dessus de 25 °C) | Toujours noter la température et appliquer la correction \(\kappa_T = \kappa_{25}[1+\alpha(T-25)]\) avec \(\alpha≈0,02\ \text{°C}^{-1}\) pour les sels forts. | | 4 | Plonger les électrodes de la conductimétrie dans un solvant organique (acétone, éthanol) | Détérioration de la surface des électrodes, dérive de la constante de cellule | Utiliser uniquement des solutions aqueuses ; si un solvant organique est nécessaire, rincer immédiatement à l’eau distillée après mesure. | | 5 | Ne pas porter de gants lors de la manipulation de sang provenant d’un patient | Risque d’exposition à des agents pathogènes (VIH, hépatites) | Porter des gants nitrile, changer de gants entre chaque échantillon, jeter les gants dans un conteneur de déchets biologiques. | | 6 | Laisser le récipient de réaction ouvert lors d’un titrage conductimétrique avec une base forte | Évaporation du solvant → variation de la concentration et de la conductivité | Effectuer le titrage dans un bécher couvert ou utiliser un agitateur magnétique avec un couvercle perforé pour limiter les pertes tout en permettant l’ajout du réactif. | --- *Fin du cours.*