CHIMIE ANALYTIQUE INSTRUMENTALE (partie 3/5)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Décrire le principe de la chromatographie en phase liquide (LC) et ses différents modes (phase normale, phase inversée, échange d’ions, exclusion stérique). - Identifier les constituants d’un système HPLC (pompe, injecteur, colonne, détecteur, système de traitement des données). - Calculer les paramètres chromatographiques clés : facteur de rétention \(k'\), sélectivité \(\alpha\), nombre de plates théoriques \(N\) et résolution \(R_s\). - Interpréter un chromatogramme afin de qualifier et quantifier un analyte dans un échantillon réel (ex. principe actif d’un médicament). - Appliquer les règles de sécurité liées à l’utilisation de solvants organiques et à la manipulation des colonnes. **Prérequis nécessaires :** - Notions de solubilité, de polarité et d’interactions moléculaires (liaisons hydrogène, forces de Van der Waals). - Connaissances de base en spectrophotométrie UV‑Vis et en préparation d’échantillons (filtration, dilution). - Maîtrise du système métrique et des unités dérivées (mL, min, µm, bar). --- ## Introduction contextualisée Dans les laboratoires de contrôle qualité des industries pharmaceutiques, agroalimentaires ou environnementales du Cameroun, la chromatographie en phase liquide constitue l’outil d’analyse le plus répandu pour garantir la conformité des produits aux normes nationales et internationales (OMS, AFNOR). Que ce soit pour doser le principe actif d’un antipaludique, détecter des résidus de pesticides dans le cacao ou vérifier la pureté d’un extrait de plante médicinale, la LC offre une sensibilité, une sélectivité et une reproductibilité supérieures à celles des méthodes classiques de titration ou de colorimétrie. Ce chapitre présente donc les fondements théoriques, les paramètres quantitatifs et une mise en situation professionnelle typique d’un technicien de laboratoire travaillant dans un centre de recherche ou une unité de production locale. --- ## I. Leçon 14 : Chromatographie en phase liquide ### 1.1 Principes de base La chromatographie en phase liquide repose sur la distribution d’un analyte entre deux phases immiscibles : une phase stationnaire solide (ou liquide liée à un support) et une phase mobile liquide qui entraîne l’échantillon à travers la colonne. La séparation résulte des différences d’affinité de chaque composé pour la phase stationnaire ; plus l’interaction est forte, plus le temps de rétention \(t_R\) est long. > **La rétention est gouvernée par l’équilibre de distribution :** > \[ > K = \frac{C_s}{C_m} > \] > où \(C_s\) est la concentration dans la phase stationnaire et \(C_m\) celle dans la phase mobile. ### 1.2 Types de chromatographie liquide | Mode | Phase stationnaire | Phase mobile typique | Application principale | |------|-------------------|----------------------|------------------------| | Phase normale (NP) | Silice polaire (–OH) | Solvant non polaire (hexane, chloroforme) | Lipides, stéroïdes | | Phase inversée (RP) | Silice modifiée C18 (hydrophobe) | Mélange eau/acétonitrile ou eau/méthanol (avec additif) | Médicaments, métabolites, pesticides | | Échange d’ions | Résine chargée (–SO₃⁻, –NH₃⁺) | Tampón aqueux (pH adapté) | Ions, acides aminés, nucléotides | | Exclusion stérique (SEC) | Gel de dextran ou de silice poreuse | Tampón aqueux | Polymères, protéines (séparation par taille) | ### 1.3 Colonnes et phases stationnaires Les colonnes utilisées en routine mesurent généralement 150 mm de longueur et 4,6 mm de diamètre interne (ID). Le matériau de base est la silice sphérique de 5 µm de diamètre de particule, parfois remplacée par des particules sub‑2 µm pour l’UPLC (Ultra‑Performance LC). La phase stationnaire est covalemment liée à la silice ; pour la RP‑C18, on greffe des chaînes octadécyle (–(CH₂)₁₈CH₃). > **La taille des particules influence directement l’efficacité :** > plus les particules sont petites, plus le nombre de plates théoriques \(N\) augmente, mais la contre‑pression augmente également (voir équation de Van Deemter). ### 1.4 Phases mobiles et solvants Le choix du solvant dépend du mode de LC et de la polarité de l’analyte. En RP‑LC, les mélanges eau/acétonitrile (ou eau/méthanol) sont les plus courants, souvent acidifiés avec 0,1 % d’acide formique ou d’acide acétique pour améliorer la protonation des bases. Les solvants doivent être de qualité HPLC (≥ 99,9 % de pureté) et filtrés à 0,45 µm avant utilisation afin d’éviter le colmatage de la colonne. ### 1.5 Détecteurs courants | Détecteur | Principe de mesure | Plage de linéarité | Avantages / limites | |-----------|-------------------|--------------------|---------------------| | UV‑Vis (DAD) | Absorption de lumière UV/visible | 10⁻⁶ – 10⁻² M | Universel pour chromophores, faible coût | | Fluorescence | Emission après excitation | 10⁻⁹ – 10⁻⁶ M | Très sensible, nécessite fluorophore | | Indice de réfraction (RI) | Variation de l’indice de réfraction | 10⁻⁴ – 10⁻² M | Universel mais sensible aux changements de T, P | | Spectrométrie de masse (MS) | Masse/charge des ions | 10⁻¹² – 10⁻⁶ M | Identification structurale, coût élevé | | Conductivité | Conductivité de la phase mobile | 10⁻⁵ – 10⁻² M | Idéal pour échange d’ions | ### 1.6 Sécurité et bonnes pratiques - Porter des gants nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection. - Effectuer les préparations de phases mobiles sous hotte aspirante afin d’éviter l’inhalation de vapeurs d’acétonitrile ou de méthanol (toxiques, classe 3). - Éliminer les déchets solvantés dans des contenants dédiés, conformément à la réglementation camerounaise sur les déchets dangereux (Arrêté n° 2005/012 du MINSEP). - Vérifier la pression de la colonne avant chaque analyse ; une pression anormale indique un colmatage ou une dégradation de la phase stationnaire. --- ## II. Leçon 15 : Calcul des paramètres chromatographiques et analyses chromatographiques ### 2.1 Temps de rétention et facteur de rétention Le temps de rétention \(t_R\) est mesuré entre l’injection et le sommet du pic. Le temps mort \(t_0\) (ou \(t_{M}\)) correspond à celui d’un composé non retenu (souvent le solvant ou un marqueur comme l’uracile en RP‑LC). > **Facteur de rétention :** > \[ > k' = \frac{t_R - t_0}{t_0} > \] > \(k'\) adimensionnel, idéalement compris entre 1 et 10 pour une bonne séparation. ### 2.2 Sélectivité La sélectivité \(\alpha\) compare la rétention de deux analytes successifs : > **Sélectivité :** > \[ > \alpha = \frac{k'_2}{k'_1} \quad (\alpha \ge 1) > \] > Un \(\alpha\) proche de 1 indique des composés difficilement séparables. ### 2.3 Nombre de plates théoriques Le nombre de plates \(N\) quantifie l’efficacité de la colonne. Deux formes courantes sont utilisées : > **Méthode du largeur à la base :** > \[ > N = 16 \left(\frac{t_R}{w_b}\right)^2 > \] > où \(w_b\) est la largeur du pic à la base (entre les points d’intersection des tangentes avec la baseline). > **Méthode du largeur à mi‑hauteur :** > \[ > N = 5,54 \left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2 > \] > avec \(w_{1/2}\) la largeur à mi‑hauteur du pic. ### 2.4 Résolution La résolution \(R_s\) mesure la capacité à séparer deux pics adjacents : > **Résolution :** > \[ > R_s = \frac{\sqrt{N}}{4}\,\frac{\alpha-1}{\alpha}\,\frac{k'_2}{1+k'_2} > \] > Une \(R_s \ge 1,5\) est considérée comme une séparation de base (baseline). ### 2.5 Équation de Van Deemter Cette équation relie la hauteur équivalente d’une plate théorique \(H\) (où \(H = L/N\), \(L\) étant la longueur de la colonne) à la vitesse linéaire \(u\) de la phase mobile : > **Van Deemter :** > \[ > H = A + \frac{B}{u} + C\,u > \] > - \(A\) : terme d’éddy diffusion (dépend de la répartition des particules). > - \(B/u\) : terme de diffusion longitudinale (inversement proportionnel à la vitesse). > - \(C\,u\) : terme de transfert de masse (augmente avec la vitesse). L’optimum de \(u\) se trouve où \(\frac{dH}{du}=0\), donnant \(u_{opt}= \sqrt{B/C}\). ### 2.6 Exemple de calcul complet **Données** (analyse RP‑C18 d’un principe actif) : - \(t_0 = 1,20\) min (marqueur uracile) - \(t_{R1} = 3,45\) min (analyte A) - \(t_{R2} = 4,10\) min (analyte B) - Largeur à la base de A : \(w_{bA}=0,30\) min - Largeur à la base de B : \(w_{bB}=0,35\) min **Calculs** : 1. Facteurs de rétention \[ k'_A = \frac{3,45-1,20}{1,20}=1,875 \] \[ k'_B = \frac{4,10-1,20}{1,20}=2,417 \] 2. Sélectivité \[ \alpha = \frac{k'_B}{k'_A}= \frac{2,417}{1,875}=1,289 \] 3. Nombre de plates \[ N_A = 16\left(\frac{3,45}{0,30}\right)^2 = 16 \times (11,5)^2 = 16 \times 132,25 = 2116 \] \[ N_B = 16\left(\frac{4,10}{0,35}\right)^2 = 16 \times (11,714)^2 = 16 \times 137,2 = 2195 \] On prend la moyenne \(N \approx 2155\). 4. Résolution \[ R_s = \frac{\sqrt{2155}}{4}\,\frac{1,289-1}{1,289}\,\frac{2,417}{1+2,417} \] \[ \sqrt{2155}=46,44 \] \[ \frac{\sqrt{N}}{4}=11,61 \] \[ \frac{\alpha-1}{\alpha}= \frac{0,289}{1,289}=0,224 \] \[ \frac{k'_2}{1+k'_2}= \frac{2,417}{3,417}=0,707 \] \[ R_s = 11,61 \times 0,224 \times 0,707 \approx 1,84 \] **Interprétation** : \(R_s = 1,84 > 1,5\) → séparation de base satisfaisante entre A et B. --- ## III. Leçon 16 : TD sur le calcul des paramètres chromatographiques et analyses chromatographiques ### 3.1 Mise en situation professionnelle Un technicien du laboratoire de contrôle qualité d’une usine de production de sirop antipaludique à Yaoundé doit vérifier la concentration du principe actif (artémisinine) dans chaque lot. La méthode officielle prescrite est une RP‑HPLC avec détection UV à 210 nm. Le technicien reçoit un échantillon dilué à 1 mg/mL, prépare une série d’étalons (0,1, 0,2, 0,4, 0,8 mg/mL) et réalise les injections en dupliquat. ### 3.2 Étude de cas : dosage d’un principe actif dans un médicament **Objectif** : déterminer la teneur en artémisinine (mg/100 mL de sirop) et vérifier la conformité à la spécification (≥ 95 % de la quantité déclarée, soit 9,5 mg/100 mL). **Données expérimentales** (moyenne des dupliquats) : | Concentration étalon (mg/mL) | Aire du pic (u.a.) | |------------------------------|--------------------| | 0,10 | 12 450 | | 0,20 | 24 980 | | 0,40 | 49 950 | | 0,80 | 99 820 | | Échantillon (sirop dilué) | 1 245 | ### 3.3 Procédure pas à pas 1. **Construction de la courbe d’étalonnage** - Tracer l’aire (y) en fonction de la concentration (x). - Régression linéaire forcée à l’origine donne la pente \(S\) : \[ S = \frac{\sum xy}{\sum x^2}= \frac{(0,10\times12450)+(0,20\times24980)+(0,40\times49950)+(0,80\times99820)}{0,10^2+0,20^2+0,40^2+0,80^2} \] \[ \sum xy = 1245+4996+19980+79856 = 106 077 \] \[ \sum x^2 = 0,01+0,04+0,16+0,64 = 0,85 \] \[ S = \frac{106077}{0,85}=124 796\; \text{u.a.·mL/mg} \] - L’équation de la droite : \(A = S \times C\). 2. **Calcul de la concentration de l’échantillon** \[ C_{échant} = \frac{A_{échant}}{S}= \frac{1 245}{124 796}=0,010\; \text{mg/mL} \] 3. **Conversion en teneur dans le sirop** L’échantillon a été dilué 1 : 10 (1 mL de sirop + 9 mL de solvant). Donc la concentration dans le sirop non dilué est : \[ C_{sirop}=0,010 \times 10 = 0,10\; \text{mg/mL}=10,0\; \text{mg/100 mL} \] La déclaration du produit est de 10 mg/100 mL (≥ 9,5 mg/100 mL). Le résultat est donc conforme. (Si une dilution erronée 1 : 100 avait été utilisée initialement, la concentration apparente aurait été 100 mg/100 mL, clairement non conforme ; le technicien doit donc vérifier le facteur de dilution avant le calcul final.) 4. **Vérification de la linéarité** - Coefficient de détermination \(R^2\) calculé à partir des résidus : proche de 0,999, confirmant une bonne linéarité sur l’intervalle 0,1–0,8 mg/mL. 5. **Conclusion** Après correction de la dilution, la teneur retrouvée est conforme (10,0 mg/100 mL). Le lot est accepté. ### 3.4 Interprétation des résultats - La pente de la courbe d’étalonnage représente la sensibilité de la méthode (u.a.·mL/mg). - Un bon \(R^2\) (> 0,99) indique l’absence d’effets de matrice significatifs. - La précision (écart-type des dupliquats) doit être ≤ 2 % pour être acceptable selon les normes pharmacopéiques. --- ## Synthèse du chapitre - **Principe de la LC** : distribution analyte entre phase stationnaire et phase mobile, séparation basée sur l’affinité différentielle. - **Modes principaux** : phase normale, phase inversée (RP‑C18 la plus répandue), échange d’ions, exclusion stérique. - **Composants d’un système HPLC** : pompe haute pression, injecteur automatique, colonne (silice modifiée), détecteur (UV‑Vis, fluorescence, RI, MS), unité de traitement des données. - **Paramètres chromatographiques** : - Facteur de rétention \(k' = (t_R-t_0)/t_0\) - Sélectivité \(\alpha = k'_2/k'_1\) - Nombre de plates \(N = 16(t_R/w_b)^2\) ou \(N = 5,54(t_R/w_{1/2})^2\) - Résolution \(R_s = \frac{\sqrt{N}}{4}\frac{\alpha-1}{\alpha}\frac{k'_2}{1+k'_2}\) - **Équation de Van Deemter** : \(H = A + B/u + C u\) ; optimisation du débit pour minimiser \(H\). - **Sécurité** : utilisation de hotte, gants nitrile, gestion des déchets solvantés, vérification de la pression de colonne. - **Application professionnelle** : préparation d’étalons, construction de courbe d’étalonnage, calcul de concentration, contrôle de la linéarité et de la précision, interprétation conformément aux spécifications. --- ## Glossaire - **Phase stationnaire** : matériau fixe dans la colonne qui interagit avec les analytes. - **Phase mobile** : solvant qui entraîne l’échantillon à travers la colonne. - **Facteur de rétention (\(k'\))** : rapport du temps de rétention excédentaire au temps mort. - **Sélectivité (\(\alpha\))** : rapport des facteurs de rétention de deux analytes successifs. - **Nombre de plates théoriques (\(N\))** : mesure de l’efficacité de la colonne (plus \(N\) est élevé, meilleure est la séparation). - **Résolution (\(R_s\))** : capacité à séparer deux pics adjacents ; \(R_s \ge 1,5\) = séparation de base. - **Équation de Van Deemter** : relation entre hauteur d’une plate \(H\) et vitesse linéaire \(u\) de la phase mobile. - **Détecteur UV‑Vis** : mesure l’absorption de lumière ultraviolette ou visible par l’analyte. - **Temps mort (\(t_0\))** : temps de rétention d’un composé non retenu (marqueur). - **Largeur à la base (\(w_b\))** : largeur du mesurée entre les points où les tangentes au pied du pic rencontrent la baseline. - **Largeur à mi‑hauteur (\(w_{1/2}\))** : largeur du pic à la moitié de sa hauteur. - **Courbe d’étalonnage** : relation linéaire entre la concentration d’un étalon et la réponse du détecteur. - **Linearité** : propriété selon laquelle la réponse du détecteur varie proportionnellement à la concentration sur un intervalle donné. - **Précision** : degré de rapprochement des mesures répétées entre elles (exprimé en écart-type ou en %RSD). - **Spécification** : limite de conformité fixée par une réglementation ou un cahier des charges (ex. teneur minimale d’un principe actif). --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 Un technicien analyse un extrait de plante médicinale contenant de la caféine par RP‑HPLC (colonne C18, 150 mm × 4,6 mm, 5 µm). Les données suivantes sont obtenues : - \(t_0 = 0,90\) min (uracile) - Pic de caféine : \(t_R = 3,60\) min, largeur à la base \(w_b = 0,28\) min **a)** Calculer le facteur de rétention \(k'\) de la caféine. **b)** Déterminer le nombre de plates théoriques \(N\) de la colonne pour cet analyte. **c)** Si un deuxième composé (théophylline) présente \(t_R = 4,20\) min et \(w_b = 0,30\) min, calculer la sélectivité \(\alpha\) entre caféine et théophylline. **d)** En utilisant les valeurs de \(k'\) et \(\alpha\) obtenues, estimer la résolution \(R_s\) entre les deux composés (supposer que \(N\) est la même pour les deux pics). **Corrigé** **a)** \[ k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}= \frac{3,60-0,90}{0,90}= \frac{2,70}{0,90}=3,0 \] **b)** \[ N = 16\left(\frac{t_R}{w_b}\right)^2 = 16\left(\frac{3,60}{0,28}\right)^2 = 16 \times (12,857)^2 = 16 \times 165,3 = 2645 \] **c)** Facteur de rétention de la théophylline : \[ k'_{th} = \frac{4,20-0,90}{0,90}= \frac{3,30}{0,90}=3,667 \] Sélectivité : \[ \alpha = \frac{k'_{th}}{k'_{caf}} = \frac{3,667}{3,0}=1,222 \] **d)** \[ \sqrt{N}= \sqrt{2645}=51,43 \] \[ \frac{\sqrt{N}}{4}=12,86 \] \[ \frac{\alpha-1}{\alpha}= \frac{0,222}{1,222}=0,182 \] \[ \frac{k'_2}{1+k'_2}= \frac{3,667}{1+3,667}= \frac{3,667}{4,667}=0,786 \] \[ R_s = 12,86 \times 0,182 \times 0,786 \approx 1,84 \] **Interprétation** : \(R_s = 1,84 > 1,5\) → séparation de base satisfaisante entre caféine et théophylline. --- ### Exercice 2 Dans un laboratoire de contrôle qualité d’une usine de boissons gazeuses à Douala, on doit déterminer la concentration de benzoate de sodium (conservateur) par HPLC‑UV à 225 nm. Une série d’étalons est préparée : | Concentration (mg/L) | Aire du pic (u.a.) | |----------------------|--------------------| | 5,0 | 8 200 | | 10,0 | 16 450 | | 20,0 | 32 900 | | 40,0 | 65 800 | Un échantillon de boisson donne une aire de 24 600 u.a. **a)** Déterminer l’équation de la droite d’étalonnage (pente \(S\) et ordonnée à l’origine \(b\)). **b)** Calculer la concentration de benzoate de sodium dans l’échantillon. **c)** Si la limite légale de benzoate de sodium dans les boissons est de 150 mg/L, conclure sur la conformité de l’échantillon. **Corrigé** **a)** Régression linéaire moindres carrés (on peut vérifier que la droite passe pratiquement par l’origine). Pente : \[ S = \frac{\sum xy}{\sum x^2} \] \[ \sum xy = (5\times8200)+(10\times16450)+(20\times32900)+(40\times65800)=41\,000+164\,500+658\,000+2\,632\,000=3\,495\,500 \] \[ \sum x^2 = 5^2+10^2+20^2+40^2 = 25+100+400+1600 = 2125 \] \[ S = \frac{3\,495\,500}{2125}=1\,645,4\; \text{u.a.·L/mg} \] Ordonnée à l’origine : \[ b = \bar{y} - S\bar{x} \] \[ \bar{x}= \frac{5+10+20+40}{4}=18,75\; \text{mg/L} \] \[ \bar{y}= \frac{8200+16450+32900+65800}{4}=30\,837,5\; \text{u.a.} \] \[ b = 30\,837,5 - 1\,645,4 \times 18,75 = 30\,837,5 - 30\,851,3 = -13,8\; \text{u.a.}\approx 0 \] On peut donc considérer \(b\approx0\) et écrire : \[ A = 1\,645,4 \, C \] **b)** \[ C_{échant}= \frac{A}{S}= \frac{24\,600}{1\,645,4}=14,95\; \text{mg/L}\approx 15,0\; \text{mg/L} \] **c)** La concentration mesurée (≈ 15 mg/L) est bien inférieure à la limite légale de 150 mg/L. L’échantillon est donc **conforme** au regard de la réglementation sur les conservateurs. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | # | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |---|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Oublier de filtrer la phase mobile avant utilisation | Colmatage de la colonne, augmentation anormale de la pression, perte d’efficacité | Filtrer à 0,45 µm (ou 0,2 µm pour UHPLC) sous hotte ; vérifier l’état du filtre avant chaque préparation. | | 2 | Utiliser un solvant périmé ou mal étiqueté | Variation de la rétention, mauvaise reproductibilité, risque de réaction toxique | Vérifier la date de péremption et l’étiquette ; conserver les solvants dans des flacons amber, bien fermés, à l’écart de la chaleur. | | 3 | Injecter un échantillon non dilué ou trop concentré | Saturation du détecteur, distorsion du pic, dépassement de la linéarité | Réaliser une dilution adaptée (souvent 1 : 10 à 1 : 100) et contrôler l’aire du pic restant dans l’intervalle linéaire de la courbe d’étalonnage. | | 4 | Négliger l’équilibrage de la colonne après changement de phase mobile | Baseline instable, temps de rétention irréproductibles | Faire passer au moins 10 volumes de colonne de la nouvelle phase mobile à débit d’équilibrage avant d’acquérir les premières injections. | | 5 | Ne pas porter de protection lors de la manipulation de solvants volatils (acétone, méthanol) | Inhalation de vapeurs toxiques, irritation cutanée | Toujours travailler sous hotte aspirante, porter gants nitrile, lunettes de sécurité et blouse de laboratoire. | | 6 | Ignorer les consignes d’élimination des déchets solvantés | Contamination de l’environnement, non‑conformité réglementaire | Collecter les déchets dans des contenants dédiés, étiquetés, et les faire évacuer par un prestataire agréé conformément à l’Arrêté n° 2005/012 du MINSEP. | --- *Fin du cours.*