CHIMIE ANALYTIQUE INSTRUMENTALE (partie 1/5)

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À l’issue de ce chapitre, l’élève sera capable de : - expliquer le principe de la spectrophotométrie UV‑visible, de l’absorption atomique et de l’émission de flamme ; - décrire le fonctionnement des principaux composants d’un spectrophotomètre (source, monochromateur, cuve, détecteur) ; - appliquer la loi de Beer‑Lambert pour déterminer une concentration inconnue à partir d’une mesure d’absorbance ; - réaliser, en toute sécurité, la préparation d’échantillons sanguins pour une analyse hématologique automatisée ; - interpréter les résultats d’un analyseur automatique d’hématologie (numération globulaire, indice moyen corpusculaire, etc.) ; - choisir la méthode analytique appropriée (UV‑vis, AA, flamme) selon la nature de l’analyte et la matrice ; - respecter les normes de sécurité et d’hygiène en laboratoire de chimie analytique au Cameroun. **Prérequis** : connaissances de base en chimie générale (structure électronique, liaisons, solutions), notions de préparation de solutions étalons, utilisation d’une balance analytique, manipulation de verrerie volumétrique, et notions de sécurité en laboratoire (port des EPI, gestion des déchets chimiques). --- ## Introduction La chimie analytique instrumentale occupe une place centrale dans les laboratoires de contrôle qualité, de recherche et de diagnostic médical au Cameroun. Les techniques spectrophotometriques permettent d’obtenir, rapidement et avec une bonne précision, des informations quantitatives sur des espèces chimiques présentes à l’état de traces dans des matrices variées (eau, sols, produits agroalimentaires, sang). Ce chapitre présente les trois premières leçons du programme officiel : la spectrophotométrie UV‑visible, son application en travaux dirigés couplée à l’étude d’un analyseur automatique d’hématologie, puis la spectrophotométrie d’absorption atomique et d’émission de flamme. Chaque partie est illustrée par des exemples concrets issus de la pratique professionnelle (contrôle de la qualité de l’eau potable, dosage de métaux lourds dans les sols, numération globulaire en milieu hospitalier). --- ## I. Spectrophotométrie UV‑visible ### A. Principe La spectrophotométrie UV‑visible mesure l’absorbance $A$ d’une solution lorsqu’elle est exposée à un rayonnement électromagnétique dans le domaine ultraviolet (200‑400 nm) et visible (400‑800 nm). Selon la loi de Beer‑Lambert : $$ A = \varepsilon \, b \, c $$ où $\varepsilon$ est le coefficient d’absorbance molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), $b$ la longueur du trajet optique (cm) et $c$ la concentration (mol·L⁻¹). > **>** La loi de Beer‑Lambert est valable tant que l’absorbance reste inférieure à 0,8 – 1,0 pour éviter les effets de déviation linéaire. ### B. Instrumentation Un spectrophotomètre UV‑visible comprend : 1. **Source de lumière** : lampe à deutérium (UV) et lampe tungstène‑halogène (visible). 2. **Monochromateur** : réseau de diffraction ou prisme permettant de sélectionner une longueur d’onde précise. 3. **Cuve** : généralement en quartz pour le UV, en verre ou plastique pour le visible. 4. **Détecteur** : photodiode ou tube photomultiplicateur (PMT) convertissant le flux lumineux en signal électrique. 5. **Système d’acquisition** : convertisseur analogique‑numérique et logiciel de traitement. ### C. Applications et protocole - **Dosage de composés organiques** (phénols, colorants, médicaments). - **Contrôle de la qualité de l’eau** : mesure du nitrate par réaction avec le sulfanilamide (méthode du cadmium réduit). - **Cinétique enzymatique** : suivi de la formation d’un produit chromogène. **Protocole type** : 1. Préparer une série d’étalons couvrant l’intervalle de concentration attendu. 2. Mesurer l’absorbance à $\lambda_{\max}$ (longueur d’onde d’absorption maximale). 3. Tracer la courbe d’étalonnage $A = f(c)$. 4. Mesurer l’absorbance de l’échantillon inconnu et déterminer sa concentration par interpolation ou équation de la droite. ### D. Exemple chiffré entièrement résolu On souhaite déterminer la concentration d’un composé X dont $\varepsilon = 2500\ \text{L·mol}^{-1}\text{·cm}^{-1}$ à $\lambda_{\max}= 340\ \text{nm}$. La cuve utilisée a $b = 1,0\ \text{cm}$. L’absorbance mesurée pour l’échantillon est $A = 0,425$. Calcul : $$ c = \frac{A}{\varepsilon \, b} = \frac{0,425}{2500 \times 1,0} = 1,70 \times 10^{-4}\ \text{mol·L}^{-1} $$ Si la masse molaire de X est $M = 180\ \text{g·mol}^{-1}$, la concentration en mg·L⁻¹ vaut : $$ c_{\text{mg/L}} = 1,70 \times 10^{-4}\ \text{mol·L}^{-1} \times 180\ \text{g·mol}^{-1} \times 1000\ \frac{\text{mg}}{\text{g}} = 30,6\ \text{mg·L}^{-1} $$ > **>** Toujours vérifier que l’absorbance mesurée se situe dans le domaine linéaire de l’étalon (généralement $0,1 < A < 0,8$). --- ## II. TD : analyse par spectrophotométrie UV‑vis et étude de l’analyseur automatique d’hématologie avec méthodes de préparation des échantillons ### A. Travaux dirigés UV‑vis Le TD vise à mettre en pratique la loi de Beer‑Lambert sur un analyte réel : le **fer (II)** complexe avec le phénanthroline (ferro‑phénanthroline) donnant une couleur rouge intense absorbant à 510 nm. **Étapes** : 1. Préparer une solution étalon de Fe²⁺ (ex. 10 mg·L⁻¹) dans un milieu acide (HCl 0,1 M). 2. Ajouter un excès de phénanthroline (1,0 mL d’une solution 0,5 % m/v) et laisser réagir 10 min. 3. Mesurer l’absorbance à 510 nm contre un blanc (reagent seul). 4. Construire l’étalon et déterminer la concentration de Fe²⁺ dans un échantillon d’eau de forage. ### B. Analyseur automatique d’hématologie Les analyseurs d’hématologie modernes (ex. **Sysmex XN‑Series**, **Abbott Cell‑Dyn**) utilisent la **spectrophotométrie d’absorption** combinée à la **détection de la lumière diffusée** pour dénombrer et caractériser les cellules sanguines. - **Principe** : le sang dilué passe dans une cuve où un laser (souvent à 635 nm) éclaire les cellules. La lumière diffusée à différents angles permet de distinguer les globules rouges (GR), les globules blancs (GB) et les plaquettes (PLT) selon leur taille et leur granularité. - **Paramètres mesurés** : numération des GR (RBC), hémoglobine (Hb), hématocrite (Ht), volume globulaire moyen (VGM), concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (MCHC), nombre de GB (WBC) avec différentiel, nombre de plaquettes (PLT). ### C. Préparation des échantillons sanguins Au Cameroun, les prélèvements sont réalisés sur du sang veineux recueilli dans des tubes contenant de l’EDTA (anticoagulant). **Procédure** : 1. Étiqueter le tube avec les informations du patient (nom, âge, heure de prélèvement). 2. Mélanger immédiatement le tube par inversion 8‑10 fois pour éviter la coagulation. 3. Conserver à 4 °C si l’analyse ne peut être faite dans les 2 h suivant le prélèvement (stabilité maximale 24 h à 4 °C). 4. Avant l’analyse, laisser le tube atteindre la température ambiante (20‑25 °C) et le remettre en suspension par agitation douce. > **>** Ne jamais centrifuger un tube d’EDTA destiné à l’hématologie, car cela provoquerait une agglutination artificielle des plaquettes. ### D. Procédure opératoire sur l’analyseur 1. Allumer l’appareil et laisser le système se stabiliser (environ 15 min). 2. Effectuer le contrôle de qualité (QC) avec des niveaux bas, moyen et haut fournis par le fabricant. 3. Aspirer 20 µL de sang bien mélangé dans la cuve d’échantillonnage. 4. L’analyseur réalise automatiquement la dilution (souvent 1:200) et la mesure. 5. Résultats affichés après ~60 s ; les valeurs sont comparées aux intervalles de référence établis pour la population camerounaise adulte (ex. Hb : 13,0‑17,5 g·dL⁻¹ chez l’homme, 12,0‑15,5 g·dL⁻¹ chez la femme). ### E. Exemple de résultat interprété Un patient présente : Hb = 10,8 g·dL⁻¹, Ht = 32 %, VGM = 78 fL, MCHC = 33,8 g·dL⁻¹, WBC = 4,2 × 10⁹·L⁻¹, PLT = 210 × 10⁹·L⁻¹. Interprétation : anémie microcytaire hypochrome (VGM bas, MCHC normale basse) suggestive d’une carence en fer, à confirmer par la ferritine sérique. > **>** Toute valeur d’hémoglobine inférieure à 8,0 g·dL⁻¹ nécessite une prise en charge urgente (transfusion éventuelle) selon les protocoles du MINSANTE. --- ## III. Spectrophotométrie d’absorption atomique et d’émission de flamme ### A. Principe d’absorption atomique (AA) Dans la spectrophotométrie d’absorption atomique, l’échantillon est atomisé (généralement dans une flamme air‑acétylène ou un four graphite) et les atomes à l’état fondamental absorbent de la lumière à une longueur d’onde caractéristique de l’élément analysé. L’absorbance suit toujours la loi de Beer‑Lambert, mais le coefficient d’absorbance $\varepsilon$ dépend de la transition atomique et de la température de la flamme. > **>** La ligne d’absorption la plus sensible est choisie (ex. 248,3 nm pour le Pb, 324,8 nm pour le Cu). ### B. Instrumentation AA - **Source** : lampe à cathode creuse (HCL) de l’élément à déterminer (ex. lampe Cu pour le cuivre). - **Système d’atomisation** : brûleur à flamme (air‑acétylène, température ~2300 K) ou four graphite (température jusqu’à 3000 K). - **Monochromateur** : sélection de la longueur d’onde analytique. - **Détecteur** : photomultiplicateur. - **Système d’acquisition** : logique similaire à l’UV‑vis. ### C. Méthode d’absorption atomique (flamme) – procédure pas à pas 1. Préparer une solution étalon de l’élément (ex. Cu²⁺) à des concentrations connues (0,0, 0,5, 1,0, 2,0 mg·L⁻¹) dans une matrice identique à celle de l’échantillon (souvent de l’acide nitrique 0,1 M pour éviter la précipitation). 2. Allumer la lampe HCL et laisser se stabiliser (5 min). 3. Régler le brûleur à la bonne proportion air/acétylène (souvent 10:1). 4. Aspirer le blanc (acide seul) pour zéro l’appareil. 5. Mesurer l’absorbance de chaque étalon, tracer la courbe d’étalonnage. 6. Aspirer l’échantillon (préalablement filtré à 0,45 µm si nécessaire) et lire son absorbance. 7. Déterminer la concentration par interpolation ou équation de la droite d’étalonnage. ### D. Spectrophotométrie d’émission de flamme (FAES) Lorsque les atomes excités dans la flamme retombent à l’état fondamental, ils émettent de la lumière à des longueurs d’onde caractéristiques. L’intensité de l’émission $I$ est proportionnelle à la concentration $c$ (dans certaines limites) : $$ I = k \, c $$ où $k$ dépend de la température de la flamme, de la transition électronique et de l’efficacité de detection. > **>** L’émission de flamme est particulièrement adaptée aux alcalins et alcalino-terreux (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Li⁺) dont les lignes d’émission sont très intenses et peu sujettes à l’auto‑absorption. ### E. Instrumentation FAES - Même brûleur que pour l’AA, mais sans lampe HCL. - Monochromateur réglé sur la longueur d’onde d’émission (ex. 589,0 nm pour Na, 766,5 nm pour K). - Détecteur photomultiplicateur ou CCD. ### F. Applications et précautions au Cameroun - **Dosage des métaux lourds** (Pb, Cd, Cu, Zn) dans les eaux de forage, les sols agricoles et les boues de stations d’épuration (méthode AA). - **Contrôle de la qualité des engrais** : mesure du K et Na par FAES. - **Surveillance de la nutrition animale** : dosage du Cu et Zn dans les aliments du bétail. **Précautions de sécurité** : - Utiliser une hotte à flux laminaire lors de la préparation des solutions acides contenant des métaux toxiques. - Porter des lunettes de protection, des gants nitrile et un tablier. - Éviter les fuites d’acétylène : vérifier les raccords et utiliser un détecteur de gaz combustible. - Éliminer les déchets contenant des métaux lourds selon la réglementation du MINEEP (déchets dangereux, stockage en fûts étiquetés). ### G. Exemple chiffré entièrement résolu (AA) On veut déterminer la concentration de cuivre dans un échantillon d’eau de rivière. - Lampe HCL Cu à 324,8 nm. - Étalons préparés : 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 mg·L⁻¹ Cu²⁺ dans HNO₃ 0,1 M. - Absorbances mesurées : | [Cu] (mg·L⁻¹) | A (UA) | |---------------|--------| | 0,0 | 0,000 | | 0,2 | 0,084 | | 0,5 | 0,210 | | 1,0 | 0,420 | | 2,0 | 0,845 | La droite d’étalonnage (régression linéaire) donne : $$ A = 0,422 \, [Cu] + 0,001 \quad (R^2 = 0,999) $$ L’échantillon donne $A = 0,318$. Calcul : $$ [Cu] = \frac{A - 0,001}{0,422} = \frac{0,318 - 0,001}{0,422} = 0,751\ \text{mg·L}^{-1} $$ > **>** Vérifier que l’absorbance de l’échantillon reste dans l’intervalle linéaire de l’étalon (ici entre 0,2 et 1,0 mg·L⁻¹). --- ## Synthèse du chapitre - **UV‑visible** : mesure d’absorbance dans 200‑800 nm, loi de Beer‑Lambert, utilisation de cuves quartz/verre, applications au dosage de composés organiques et de nitrates. - **TD UV‑vis + hématologie** : préparation d’étalons, mesure à $\lambda_{\max}$, utilisation d’analyseurs automatiques basés sur la diffusion et l’absorption de lumière, préparation d’échantillons sanguins avec EDTA, interprétation des paramètres hématologiques. - **Absorption atomique (AA)** : atomisation dans flamme ou four graphite, absorption de lumière caractéristique, méthode d’étalonnage, dosage des métaux lourds. - **Émission de flamme (FAES)** : mesure de la lumière émise par les atomes excités, idéale pour Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Li⁺, procédure similaire à l’AA mais sans lampe HCL. - **Sécurité** : port des EPI, travail sous hotte, vérification des fuites d’acétylène, gestion des déchets métalliques. - **Formules clés** : $A = \varepsilon b c$, $I = k c$, $c = (A - b)/m$ (où $m$ est la pente de l’étalonnage). --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | Absorbance ($A$) | Logarithme décimal du rapport de l’intensité du rayonnement incident sur celle transmise par l’échantillon. | | Coefficient d’absorbance molaire ($\varepsilon$) | Constante de proportionnalité dans la loi de Beer‑Lambert, exprimée en L·mol⁻¹·cm⁻¹. | | Lampe à cathode creuse (HCL) | Source de lumière linéaire et étroite utilisée en AA pour fournir des photons à la longueur d’onde caractéristique de l’élément analysé. | | Flamme air‑acétylène | Mélange gazeux produisant une température d’environ 2300 K, utilisée pour l’atomisation en AA et FAES. | | Four graphite | dispositif de chauffage électrothermique permettant d’atteindre des températures > 2500 K pour l’atomisation en AA sans flamme. | | Étalonnage | procédure consistant à mesurer la réponse de l’instrument pour plusieurs concentrations connues afin de construire une courbe de référence. | | Hématologie automatique | analyseur qui,numère et caractérise les cellules sanguines à partir de la diffusion et de l’absorption de la lumière. | | EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) | agent chélateur utilisé comme anticoagulant dans les tubes de prélèvement sanguin pour l’hématologie. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Dosage UV‑vis d’un colorant alimentaire Un extrait de boisson gazeuse contient un colorant jaune dont $\varepsilon = 18\,500\ \text{L·mol}^{-1}\text{·cm}^{-1}$ à 425 nm. La cuve utilisée a une longueur de trajet de 1,00 cm. L’absorbance mesurée est $A = 0,642$. **a)** Calculer la concentration du colorant en mol·L⁻¹. **b)** Si la masse molaire du colorant est 450 g·mol⁻¹, exprimer le résultat en mg·L⁻¹. **Corrigé** a) $c = A/(\varepsilon b) = 0,642/(18\,500 \times 1,00) = 3,47 \times 10^{-5}\ \text{mol·L}^{-1}$ b) $c_{\text{mg/L}} = 3,47 \times 10^{-5}\ \text{mol·L}^{-1} \times 450\ \text{g·mol}^{-1} \times 1000 = 15,6\ \text{mg·L}^{-1}$ --- ### Exercice 2 – Détermination du potassium par émission de flamme Une solution étalon de K⁺ est préparée à 0,0, 5,0, 10,0, 20,0 mg·L⁻¹. Les intensités d’émission mesurées à 766,5 nm sont respectivement : 0,0, 12,3, 24,8, 49,5 UA. **a)** Déterminer l’équation de la droite d’étalonnage (intensité = $k \times$[K] + $b$). **b)** Un échantillon de jus de fruit donne une intensité de 37,2 UA. Calculer la concentration de K⁺ dans le jus. **Corrigé** a) Régression linéaire donne $k = 2,48\ \text{UA·L·mg}^{-1}$, $b = 0,15\ \text{UA}$. Donc $I = 2,48\,[\text{K}^+] + 0,15$. b) $[\text{K}^+] = (I - b)/k = (37,2 - 0,15)/2,48 = 14,96\ \text{mg·L}^{-1}$ ≈ 15,0 mg·L⁻¹. --- ### Exercice 3 – Préparation d’un échantillon sanguin pour l’hématologie Un technicien doit préparer 5 tubes de 4 mL de sang total avec EDTA à partir d’un prélèvement de 25 mL de sang veineux. **a)** Quel volume de solution d’EDTA à 15 % (m/v) doit-il ajouter à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 1,5 % (m/v) d’EDTA dans le sang ? **b)** Après ajout, quel est le volume total de chaque tube et quelle est la proportion de sang dans le mélange ? **Corrigé** a) On veut $C_f V_f = C_i V_i + C_{EDTA} V_{EDTA}$. Ici $C_f = 1,5\%$, $V_f = 4\ \text{mL}$, $C_i = 0\%$ (sang sans EDTA), $C_{EDTA}=15\%$. Donc $1,5 \times 4 = 15 \times V_{EDTA}$ → $V_{EDTA}= (6)/15 = 0,40\ \text{mL}$ d’EDTA par tube. b) Volume total = sang (3,6 mL) + EDTA (0,40 mL) = 4,0 mL. Proportion de sang = $3,6/4,0 = 0,90$ soit 90 % du volume. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | Situation | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |-----------|------------------|-------------|--------------------------------------| | Mesure UV‑vis | Utiliser une cuve en verre pour une lecture en UV (< 300 nm) | Absorbance fausse (verre absorbe UV) | Toujours employer une cuve en quartz pour le domaine UV. | | Étalonnage AA | Oublier de matcher la matrice (acide) des étalons et de l’échantillon | Effet de matrice → biais de concentration | Préparer les étalons dans la même solution d’acide que l’échantillon (ex. HNO₃ 0,1 M). | | Flamme AA/FAES | Régler un débit d’acétylène trop riche → flamme jaune, température basse | Sensibilité réduite, risque d’explosion | Vérifier le rapport air/acétylène avec un manomètre ; flamme bleue claire indique bon réglage. | | Préparation sanguine EDTA | Mélanger insuffisamment après ajout d’EDTA | Caillots locaux → fausse numération | Inverser le tube 8‑10 fois immédiatement après prélèvement. | | Lecture hématologie automatique | Ne pas effectuer le contrôle de qualité (QC) avant les patients | Résultats non fiables, risque de mauvais diagnostic | Réaliser toujours un bas, moyen et haut QC selon les recommandations du fabricant. | | Gestion des déchets | Jeter les solutions contenant du Pb ou Cd dans l’évier | Contamination de l’eau, risque sanitaire | Collecter les déchets métalliques dans des récipients étiquetés « déchets dangereux » et les remettre au service de traitement agréé du MINEEP. | --- *Fin de la fiche de cours.*