Bactériologie systématique (partie 2/3)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Décrire les caractéristiques morphologiques, coloration de Gram et principaux tests biochimiques des bacilles à Gram positif et à Gram négatif. - Identifier, à l’aide d’un protocole de laboratoire standard, un bacille isolé à partir d’échantillons alimentaires, environnementaux ou cliniques courants au Cameroun. - Interpréter les résultats des tests (catalase, oxydase, fermentation des sucres, production d’indol, d’H₂S, d’uréase, etc.) et proposer une identification présumée. - Appliquer les règles d’hygiène, de biosécurité et de manipulation des agents pathogènes en milieu de travail (laboratoire d’analyse, industrie agroalimentaire, établissement de santé). - Rédiger un rapport d’analyse conforme aux exigences du MINESEC/IGE (objectifs, méthodologie, résultats, conclusion). **Prérequis :** - Connaissances de base en microbiologie générale (structure cellulaire, métabolisme, croissance bactérienne). - Maîtrise de la technique de coloration de Gram et de l’utilisation du microscope optique (objectif 40×, immersion huile). - Notions de sécurité en laboratoire (port du blouse, gants, lunettes, manipulation des déchets biologiques). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les industries agroalimentaires (lait, viande, produits fermentés) et les structures de santé sont confrontées quotidiennement à la présence de bactéries pouvant altérer la qualité des produits ou provoquer des infections nosocomiales. Les bacilles à Gram positif (ex. *Bacillus*, *Clostridium*, *Listeria*) et à Gram négatif (ex. *Escherichia*, *Salmonella*, *Pseudomonas*) sont parmi les principaux agents responsables de ces problématiques. Une identification fiable, rapide et économique repose sur la coloration de Gram suivie de tests biochimiques simples réalisables avec les réactifs disponibles dans les laboratoires techniques des lycées et des centres de formation professionnelle. Ce chapitre propose une approche par compétences : l’élève apprend non seulement à reconnaître les caractéristiques morphologiques et biochimiques de ces groupes, mais aussi à les mettre en œuvre dans des situations professionnelles réalistes (contrôle qualité d’un yaourt, investigation d’une intoxication alimentaire, surveillance d’un poste de travail hospitalier). --- ## I. Leçon 12 : Les bacilles à Gram positif ### A. Définition et caractéristiques morphologiques > Les bacilles à Gram positif sont des bactéries en forme de bâtonnet qui retiennent le colorant cristal violet lors de la coloration de Gram, apparaissant violettes au microscope. Ils possèdent une paroi peptidoglycanique épaisse (20‑80 nm) entourée d’une couche de teichoïques, sans membrane externe. ### B. Principaux genres rencontrés au Cameroun | Genre | Sporulation | Environnement typique | Pathogénicité notable | |----------------|-------------|-----------------------|-----------------------| | *Bacillus* | Oui | Sol, poussière, aliments secs | *B. anthracis* (anthrax) | | *Clostridium* | Oui | Anaérobies, sols, intestins | *C. botulinum* (botulisme) | | *Listeria* | Non | Milieux humides, produits laitiers | *L. monocytogenes* (listériose) | | *Corynebacterium* | Non | Peau, muqueuses respiratoires | *C. diphtheriae* (diphtérie) | | *Bacillus subtilis* (souche non pathogène) | Oui | Sol, fermentation | Utilisé en industrie enzymatique | ### C. Méthode de coloration de Gram – pas à pas 1. **Préparation du frottis** : étaler une goutte d’échantillon sur lame, laisser sécher à l’air, fixer à la flamme (3 s). 2. **Coloration primaire** : couvrir de cristal violet 1 min, rincer à l’eau distillée. 3. **Mordançage** : ajouter lugol (iode‑potassium) 1 min, rincer. 4. **Décoloration** : passer rapidement de l’alcool éthylique 95 % (2‑3 s) jusqu’à ce que le liquide soit clair. 5. **Coloration de contraste** : safranine 45 s, rincer, sécher à l’air. 6. **Observation** : objectif 40×, puis immersion huile 100×. Les bacilles apparaissent violets. > La décoloration trop prolongée entraîne une perte du cristal violet et un faux résultat Gram‑négatif ; il faut donc surveiller la transparence du liquide. ### D. Tests biochimiques usuels (schéma de dépistage) | Test | Réactif / milieu | Résultat positif (exemple) | Interprétation | |--------------------|-----------------------|----------------------------|----------------| | Catalase | H₂O₂ 3 % | Formation de bulles d’O₂ | Présence de catalase (typique *Bacillus*, *Listeria*) | | Oxydase | Reagent oxydase (tétraméthyl‑p‑phénylènediamine) | Coloration bleue en ≤10 s | Présence de cytochrome c oxydase (négatif pour la plupart des bacilles à Gram +) | | Fermentation du glucose | Bouillon de peptone + glucose + indicateur de pH (rouge de phénol) | Jaunissement (production d’acide) | Fermentation acide du glucose | | Réduction des nitrates | Bouillon de nitrates + réactifs A (sulfanilamide) + B (naphthyléthylène diamine) | Coloration rouge | Réduction de NO₃⁻ → NO₂⁻ | | Production d’acétylméthylcarbinol (test VP) | Réactifs VP (α‑naphtol + KOH) | Rouge rosé | Présence de voie butanediol (ex. *Bacillus subtilis*) | | Hydrolyse de l’amidon | Milieu d’amidon + lugol | Zone claire autour de la colonie | Production d’amylase (typique *Bacillus*) | ### E. Pathogénicité et exemples de maladies au Cameroun - **Anthrax** (*Bacillus anthracis*) : atteinte cutanée chez les travailleurs agricoles manipulant des peaux ou des carcasses d’animaux infectés. - **Botulisme** (*Clostridium botulinum*) : intoxication alimentaire liée à la consommation de produits en conserve mal stérilisés (ex. pâte d’arachide maison). - **Listériose** (*Listeria monocytogenes*) : méningite ou septicémie chez les femmes enceintes, les personnes immunodéprimées, souvent associée à la consommation de lait cru ou de fromages non pasteurisés. - **Diphtérie** (*Corynebacterium diphtheriae*) : infection respiratoire pouvant entraîner une pseudomembrane pharyngée, encore observée dans certaines zones rurales où la couverture vaccinale est faible. ### F. Mesures de prévention et d’hygiène en milieu de travail - Port obligatoire de gants nitrile, blouse et lunettes lors de la manipulation d’échantillons suspects. - Décontamination des surfaces avec une solution d’hypochlorite de sodium 0,5 % (5000 ppm) pendant 10 min. - Autoclave des déchets solides à 121 °C, 15 psi pendant 20 min avant élimination. - Vaccination antitétanique et anti‑diphtérique mise à jour pour le personnel de laboratoire et d’industrie agroalimentaire. - Utilisation de postes de sécurité biologique (Niveau 2) pour les manipulations pouvant générer des aérosols (ex. vortexage de suspensions). ### G. Exemple d’atelier : identification d’un *Bacillus* spp. à partir d’un échantillon de sol 1. **Prélèvement** : prélever 1 g de sol superficiel avec une spatule stérile, le placer dans un tube contenant 9 mL d’eau peptonnée 0,1 %. 2. **Décimalisation** : réaliser une série de dilutions 10⁻¹ à 10⁻⁴. 3. **Ensemencement** : étaler 100 µL de chaque dilution sur gélose nutritive (GN) en duplicate. 4. **Incubation** : 30 °C, 24‑48 h. 5. **Observation des colonies** : colonies larges, irrégulières, souvent opaques. 6. **Coloration de Gram** : confirmer la forme bacillaire et la coloration violette. 7. **Tests biochimiques** : catalase (+), oxydase (–), fermentation du glucose (+), réduction des nitrates (+), hydrolyse de l’amidon (+). 8. **Conclusion** : profil compatible avec *Bacillus subtilis* groupe (non pathogène). --- ## II. ACTIVITES D’INTEGRATION ### A. Mise en situation : contrôle qualité d’un produit laitier Une unité de transformation de yaourt au Cameroun reçoit une plainte concernant une texture granuleuse et un goût acidulé excessif. Le responsable qualité demande une analyse microbiologique pour détecter d’éventuelles contaminations par des bacilles à Gram positif pouvant produire des acides ou des enzymes protéolytiques. ### B. Procédure d’isolement et d’identification 1. **Prélevement** : 25 g de yaourt prélevés aseptiquement, homogénéisés dans 225 mL de peptone eau (dilution 10⁻¹). 2. **Ensemencement sélectif** : répartir 100 µL sur gélose Mannitol Salt Agar (MSA) – sélective pour *Staphylococcus* et certains *Bacillus* tolérants au sel – et sur gélose Pseudomonas Agar (PA) – pour éliminer les contaminants à Gram négatif. 3. **Incubation** : 37 °C, 24‑48 h (MSA) ; 30 °C, 24‑48 h (PA). 4. **Choix des colonies** : sur MSA, colonies jaunes (fermentation du mannitol) → présomption *Staphylococcus aureus* (à éliminer) ; colonies rouges/rose non jaunissantes → présomption *Bacillus* spp. 5. **Coloration de Gram** : confirmer bacille à Gram positif. 6. **Tests biochimiques rapides** : catalase (+), oxydase (–), fermentation du glucose (+), production d’acétylméthylcarbinol (VP –), hydrolyse de l’amidon (+). 7. **Interprétation** : profil correspondant à *Bacillus licheniformis* (producteur de protéases pouvant expliquer la texture granuleuse). ### C. Rédaction du rapport - **Objectif** : détecter et identifier les bacilles à Gram positif responsables de l’altération du yaourt. - **Méthode** : prélèvement, dilution, ensemencement sur MSA et PA, incubation, coloration de Gram, tests catalase, oxydase, glucose, VP, amidon. - **Résultats** : colonies rouges sur MSA, bacilles à Gram positif, catalase +, oxydase –, glucose +, VP –, amidon + → *B. licheniformis*. - **Conclusion** : contamination probablement survenue lors de l’ajout du ferment ou lors d’une pause de nettoyage insuffisante ; recommandation : renforcer le contrôle de l’hygiène du matériel de mélange et réaliser un test de présence de spores avant chaque lot. ### D. Synthèse des compétences mobilisées - Application de la coloration de Gram et interprétation. - Sélection et utilisation de milieux sélectifs/différentiels. - Réalisation et lecture de tests biochimiques de base. - Analyse critique des résultats en lien avec la qualité du produit. - Communication écrite conforme aux normes professionnelles. --- ## III. Leçon 13 : Les bacilles à Gram négatif ### A. Définition et caractéristiques morphologiques > Les bacilles à Gram négatif sont des bactéries en forme de bâtonnet qui ne retiennent pas le cristal violet lors de la coloration de Gram, apparaissant roses grâce à la safranine. Ils possèdent une paroi peptidoglycanique fine (2‑7 nm) située entre une membrane interne et une membrane externe riche en lipopolysaccharides (LPS). ### B. Principaux genres rencontrés au Cameroun | Genre | Famille principale | Habitat / source fréquente | Pathogénicité notable | |----------------|--------------------|----------------------------|-----------------------| | *Escherichia* | Enterobacteriaceae | Eau, selles, aliments contaminés | *E. coli* O157:H7 (gastro‑entérite hémorragique) | | *Salmonella* | Enterobacteriaceae | Viande crue, œufs, lait cru | *S. Typhimurium* (gastro‑entérite) | | *Shigella* | Enterobacteriaceae | Eau souillée, aliments manipulés | *S. flexneri* (dysenterie bacillaire) | | *Klebsiella* | Enterobacteriaceae | Environnement humide, voies respiratoires | *K. pneumoniae* (pneumonie nosocomiale) | | *Proteus* | Enterobacteriaceae | Eau, sols, intestins | *P. mirabilis* (infections urinaires, pierres) | | *Pseudomonas* | Pseudomonadaceae | Sol, eau, surfaces humides | *P. aeruginosa* (infections opportunistes, brûlures) | | *Haemophilus* | Pasteurellaceae | Secrétions respiratoires | *H. influenzae* (méningite, otite) | | *Acinetobacter*| Moraxellaceae | Environnement hospitalier | *A. baumannii* (infections résistantes) | ### C. Rappel de la coloration de Gram – points critiques - La membrane externe des Gram‑ négatifs est perméable à l’alcool‑décolorant, permettant l’élimination du cristal violet. - Une décoloration insuffisante donne un faux positif (apparence violette). - Utiliser de l’alcool éthylique 95 % ou un mélange acétone‑alcool (1:1) pour une décoloration efficace. ### D. Tests biochimiques usuels (schéma de dépistage Enterobacteriaceae) | Test | Réactif / milieu | Résultat positif (exemple) | Interprétation | |--------------------|-----------------------|----------------------------|----------------| | Oxydase | Reagent oxydase (tétraméthyl‑p‑phénylènediamine) | Pas de coloration (négatif) | Typique des Enterobacteriaceae | | Catalase | H₂O₂ 3 % | Bulles d’O₂ | Présent chez la plupart | | Fermentation du lactose | Gélose MacConkey (lactose + rouge neutre) | Colonies roses → fermentation du lactose | *E. coli*, *Klebsiella* | | Production d’indol | Tryptophane + réactif de Kovacs | Anneau rouge | *E. coli*, *Klebsiella* oxygénée | | Utilisation du citrate | Simmons citrate agar | Croissance + bleuissement | *Klebsiella*, *Enterobacter* | | Uréase | Urée agar + indicateur pH | Rose → production d’ammoniaque | *Proteus*, *Klebsiella* | | Production d’H₂S | Gélose ferrique + thiosulfate | Noircissement du milieu | *Proteus*, *Salmonella* | | Motilité | Milieu de semi‑solidité (0,3 % agar) | Troublissement | *Proteus*, *Pseudomonas* | > La combinaison lactose (+), indol (+), oxydase (–) oriente vers *Escherichia coli* ; lactose (+), indol (–), citrate (+) oriente vers *Klebsiella pneumoniae*. ### E. Pathogénicité et exemples de maladies au Cameroun - **Gastro‑entérites** : *E. coli* entérohémorragique (EHEC) provenant de viande bovine mal cuite ; *Salmonella* spp. provenant de volaille ou d’œufs contaminés. - **Fièvre typhoïde** : *Salmonella Typhi* transmise par l’eau ou les aliments souillés par des matières fécales. - **Infections urinaires** : *E. coli* (80 % des cas), *Klebsiella pneumoniae*, *Proteus mirabilis* – fréquentes chez les femmes et les patients catheterisés. - **Pneumonies nosocomiales** : *Pseudomonas aeruginosa* et *Acinetobacter baumannii* chez les patients sous ventilation mécanique ou en réanimation. - **Méningites** : *Haemophilus influenzae* de type b (encore observé dans les zones où la vaccination Hib est incomplète). ### F. Mesures de prévention et d’hygiène (laboratoire, industrie, santé) - Utilisation de postes de sécurité biologique Niveau 2 pour les manipulations pouvant générer des aérosols (ex. vortexage de suspensions de selles). - Décontamination des surfaces avec une solution d’alcool à 70 % ou d’hypochlorite 0,1 % (1000 ppm) après chaque travail. - Tri des déchets : liquides infectés dans des contenants rigides étiquetés, autoclavés avant élimination. - Surveillance de l’hygiène des mains : lavage au savon antibactérien suivi d’une friction à l’alcool pendant 30 s. - Vaccination anti‑Hib et anti‑typhoïde recommandée pour le personnel exposé (agents de santé, travailleurs des marchés alimentaires). ### G. Exemple d’atelier : identification d’une *Salmonella* spp. à partir d’échantillon de viande hachée 1. **Prélèvement** : 25 g de viande hachée prélevés aseptiquement, mélangés à 225 mL de peptone eau (dilution 10⁻¹). 2. **Enrichissement** : incubation du mélange à 37 °C pendant 18‑24 h dans du bouillon de sel de Rappaport‑Vassiliadis (RVS) – sélectif pour *Salmonella*. 3. **Ensélection** : étaler 100 µL du enrichissement sur gélose Xylose Lysine Désoxycholate (XLD) et sur gélose Hektoen Enterique (HE). 4. **Incubation** : 37 °C, 24 h. 5. **Observation des colonies** : sur XLD, colonies rouges avec centre noir (production d’H₂S) → présomption *Salmonella*. 6. **Coloration de Gram** : confirmer bacille à Gram négatif. 7. **Tests biochimiques rapides** : oxydase (–), catalase (+), fermentation du glucose (+), production d’H₂S (+), utilisation du citrate (–), indol (–), uréase (–). 8. **Confirmation** : test d’agglutination avec antisérum polyvalent *Salmonella* (O et H). 9. **Conclusion** : présence de *Salmonella* spp. – lot à retirer du marché, notification aux autorités sanitaires. --- ## ## Synthèse du chapitre - **Bacilles à Gram positif** : paroi peptidoglycane épaisse, couleur violette, genres majeurs (*Bacillus*, *Clostridium*, *Listeria*, *Corynebacterium*). Tests clés : catalase, oxydase, fermentation du glucose, réduction des nitrates, hydrolyse de l’amidon, VP. - **Bacilles à Gram négatif** : paroi fine + membrane externe LPS, couleur rose, genres majeurs (*Escherichia*, *Salmonella*, *Shigella*, *Klebsiella*, *Proteus*, *Pseudomonas*, *Haemophilus*, *Acinetobacter*). Tests clés : oxydase (–), catalase (+), fermentation du lactose, production d’indol, utilisation du citrate, uréase, H₂S, motilité. - **Méthode de coloration de Gram** : fixation, cristal violet, lugol, décoloration alcool, safranine. La décoloration doit être juste suffisante pour enlever le colorant des Gram‑ négatifs sans affecter les Gram‑ positifs. - **Pathogénicité** : anthrax, botulisme, listériose, diphtérie (Gram +); gastro‑entérites, fièvre typhoïde, infections urinaires, pneumonies nosocomiales, méningites (Gram ‑). - **Prévention** : EPI, décontamination hypochlorite/alcool, autoclave des déchets, vaccination, postes de sécurité biologique Niveau 2, bonnes pratiques d’hygiène en industrie agroalimentaire et en santé. - **Ateliers pratiques** : isolement d’un *Bacillus* à partir de sol, contrôle qualité d’un yaourt, recherche de *Salmonella* dans de la viande hachée – chaque atelier intègre prélèvement, enrichment, ensélection, coloration de Gram, tests biochimiques, interprétation et rédaction de rapport. --- ## ## Glossaire - **Bacille** : bactérie en forme de bâtonnet (longueur généralement 1‑10 µm). - **Coloration de Gram** : technique différentielle qui sépare les bactéries selon la capacité de leur paroi à retenir le cristal violet. - **Paroi peptidoglycane** : polymère constitué de chaînes de N‑acétylglucosamine et N‑acétylmuramique réticulées par des peptides, conférant rigidité à la cellule. - **Membrane externe** : bicouche lipidique propre aux Gram‑ négatifs contenant des lipopolysaccharides (LPS) et des porines. - **Catalase** : enzyme qui décompose le peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène, détectée par la formation de bulles. - **Oxydase** : enzyme de la chaîne respiratoire qui oxyde le réactif tétraméthyl‑p‑phénylènediamine, donnant une couleur bleue. - **Fermentation du lactose** : métabolisme du lactose produisant de l’acide détecté par le changement de pH du milieu (ex. MacConkey). - **Production d’indol** : dégradation du tryptophane en indole, détectée par le réactif de Kovacs (anneau rouge). - **Utilisation du citrate** : capacité à utiliser le citrate comme seule source de carbone, mise en évidence par le bleuissement du milieu Simmons citrate. - **Uréase** : enzyme hydrolysant l’urée en ammoniaque et dioxyde de carbone, détectée par l’alcalinisation du milieu (rose). - **Production d’H₂S** : réduction du thiosulfate ou du sulfure en sulfure d’hydrogène, provoquant un noircissement du milieu contenant des sels de fer. - **Motilité** : capacité de déplacement grâce à des flagelles, mise en évidence dans un milieu semi‑solide. - **Spore** : forme de résistance hautement résistante à la chaleur, aux désinfectants et à la dessiccation, produite par certains *Bacillus* et *Clostridium*. - **Lipopolysaccharide (LPS)** : composant de la membrane externe des Gram‑ négatifs, responsable de l’endotoxémie et de la stimulation de la réponse immunitaire. --- ## ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Contrôle qualité d’un lot de lait pasteurisé **Situation** : Un centre de collecte de lait reçoit une plainte concernant un goût « fermé » et une légère coagulation après 48 h de stockage à 4 °C. Le responsable qualité soupçonne une contamination par des bacilles à Gram positif capables de produire des enzymes protéolytiques à basse température. **Consigne** : Décrire, étape par étape, la procédure que vous suivriez pour isoler et identifier le contaminant présumé, en incluant : 1. Le prélèvement et la dilution. 2. Le choix du milieu d’isolement sélectif/différentiel. 3. La coloration de Gram et les observations attendues. 4. Deux tests biochimiques de confirmation pertinents. 5. Les mesures correctives à proposer si le résultat confirme la présence de *Bacillus cereus*. **Corrigé** : 1. **Prélèvement** : prélever 25 mL de lait aseptiquement dans un flacon stérile, ajouter 225 mL de peptone eau 0,1 % (dilution 10⁻¹). Réaliser ensuite des dilutions en série jusqu’à 10⁻⁴. 2. **Milieu d’isolement** : utiliser la gélose Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) – sélective pour *Bacillus cereus* grâce au polymyxin B et à l’absence de lactose, différentielle par la libération de lécitinase (zone opaque autour des colonies) et la mancitol fermentation (jaunissement). 3. **Coloration de Gram** : préparer un frottis à partir d’une colonie typique (large, irrégulière, opaque). Après coloration, observer des bacilles à Gram positif (violets). 4. **Tests biochimiques** : - **Catalase** : déposer une goutte de H₂O₂ 3 % sur la colonie → formation immédiate de bulles (catalase +). - **Test de la lécitinase** (déjà observé sur MYP) : présence d’une zone opaque autour de la colonie indique production de lécitinase, caractéristique de *B. cereus*. - (Optionnel) **Test de la résistance à la chaleur** : chauffer une suspension à 80 °C pendant 15 min, puis ensemencer sur gélose nutritive ; survie indique présence de spores. 5. **Mesures correctives** : - Retirer immédiatement le lot concerné du circuit de distribution. - Effectuer un nettoyage en profondeur du réservoir de pasteurisation et des tuyauteries avec une solution d’hypochlorite 0,5 % suivie d’un rinçage à l’eau chaude (≥80 °C). - Vérifier l’efficacité de la pasteurisation (température ≥72 °C pendant 15 s) à l’aide d’un enregistreur de température. - Former le personnel sur l’importance de la bonne fermeture des vannes et de l’entretien des joints d’étanchéité. - Mettre en place un contrôle environnemental (prélevements de surfaces, d’air) hebdomadaire pour détecter toute récontamination. --- ### Exercice 2 – Investigation d’une intoxication alimentaire lors d’un mariage **Situation** : Après un repas de mariage servi dans un restaurant de Yaoundé, 12 invités présentent des vomissements et des diarrhées aqueuses 6 à 12 h après le repas. Le plat suspect est un poulet grillé accompagné de sauce à base de tomate. Le responsable hygiène demande une analyse microbiologique pour rechercher des bacilles à Gram négatif entéropathogènes. **Consigne** : a) Proposer un schéma de recherche incluant un étape d’enrichissement, un milieu sélectif et deux tests biochimiques de discrimination entre *Escherichia coli* entérohémorragique (EHEC) et *Salmonella* spp. b) Indiquer les résultats attendus pour chaque pathogène. c) Décrire une mesure de prévention spécifique à mettre en place dans la cuisine du restaurant. **Corrigé** : a) **Schéma de recherche** : - **Prélèvement** : prélever 25 g de sauce et 25 g de viande, homogénéiser séparément dans 225 mL de peptone eau (dilution 10⁻¹). - **Enrichissement** : incuber chaque mélange à 37 °C pendant 18‑24 h dans du bouillon de sel de Rappaport‑Vassiliadis (RVS) – sélectif pour *Salmonella* – et dans du bouillon de tryptone soja enrichi en novobiocine (TSB+N) – sélectif pour *E. coli* O157:H7. - **Ensélection** : étaler 100 µL de chaque enrichissement sur gélose Xylose Lysine Désoxycholate (XLD) et sur gélose Sorbitol MacConkey (SMAC). - **Tests biochimiques** : 1. **Oxydase** : négatif pour les deux genres (aide à éliminer les Pseudomonas). 2. **Fermentation du sorbitol** (sur SMAC) : *E. coli* O157:H7 ne fermente pas le sorbitol → colonie incolore ; *E. coli* commensal fermente le sorbitol → colonie rose. 3. **Production d’H₂S** (sur XLD) : *Salmonella* produit généralement de l’H₂S → colonie noire au centre ; la plupart des *E. coli* ne produisent pas d’H₂S. b) **Résultats attendus** : - *Salmonella* spp. : croissance sur XLD et RVS, colonies noires (H₂S +), oxydase –, catalase +, fermentation du glucose +, sorbitol + (sur SMAC), uréase variable selon l’espèce. - *E. coli* O157:H7 (EHEC) : croissance sur SMAC et TSB+N, colonies incolores (sorbitol –), oxydase –, catalase +, fermentation du glucose +, indol +, H₂S –, production de toxine Shiga (détectée par test ELISA ou PCR, non réalisée au niveau du lycée mais suspectée si le tableau clinique correspond). c) **Mesure de prévention** : former le personnel de cuisine à la séparation stricte des équipements utilisés pour la viande crue et ceux destinés aux sauces ou aux légumes prêts à consommer ; nettoyer et désinfecter les planches à découper, les couteaux et les surfaces de travail avec une solution d’hypochlorite 0,1 % après chaque préparation de viande crue ; vérifier la température interne du poulet grillé (≥75 °C) à l’aide d’un thermomètre à sonde avant le service. --- ## ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | # | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de sécurité / bonne pratique | |---|------------------|-------------|------------------------------------| | 1 | **Décoloration trop longue** lors de la coloration de Gram (alcool laissé plus de 5 s) | Les bacilles à Gram positif perdent le cristal violet → faux résultat Gram‑ négatif → mauvaise orientation des tests biochimiques. | Chronométrer la décoloration avec un chronomètre ; arrêter dès que le liquide sortant de la lame devient clair (généralement 2‑3 s). Utiliser de l’alcool éthylique 95 % frais. | | 2 | **Oublier de flamer l’anse d’ensemencement** entre deux prélèvements sur le même milieu | Contamination croisée, apparition de colonies mixtes, difficulté d’interprétation. | Flamer l’anse jusqu’à rouge vif avant chaque ensemencement ; laisser refroidir quelques secondes sur le milieu chaud avant de toucher l’agar. | | 3 | **Utiliser un réactif périmé** (ex. réactif de Kovacs pour l’indol) | Résultat faux négatif ou positif, mauvaise identification. | Vérifier la date de péremption avant chaque série de tests ; conserver les réactifs au frais et à l’obscurité ; renouveler mensuellement les solutions sensibles. | | 4 | **Ne pas porter de lunettes de protection** lors de la manipulation de l’alcool ou de l’hypochlorite | Risque de projection oculaire, irritation ou brûlure. | Porter systématiquement des lunettes de sécurité anti‑projection ; en cas de contact, rincer immédiatement à l’eau abondante pendant au moins 15 min et consulter un infirmier. | | 5 | **Incuber à une température inadéquate** (ex. 25 °C au lieu de 37 °C pour les entérobactéries) | Croissance lente ou absente, faux négatif. | Respecter les températures recommandées pour chaque milieu (généralement 37 °C pour les pathogènes intestinaux, 30 °C pour les environnementaux) ; utiliser un incubateur avec affichage de température et vérifier quotidiennement. | | 6 | **Jeter les déchets liquides non traités** dans l’évier ordinaire | Risque de diffusion d’agents pathogènes dans l’environnement. | Autoclaver tous les liquides contaminés (minimum 121 °C, 15 psi, 20 min) avant élimination ; utiliser des contenants rigides étiquetés « déchets biologiques ». | --- *Fin du cours.*