9- Effectuer des examens bactériologiques des produits pathogènes et antigène (partie 1/2)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Réaliser, selon les bonnes pratiques de laboratoire, la collecte, le transport et la mise en culture d’échantillons d’urine, de selles, de crachats et de sang. - Appliquer les techniques de coloration (Gram, Ziehl‑Neelsen) et les tests biochimiques usuels pour identifier les principaux pathogènes bactériens rencontrés en milieu clinique camerounais. - Interpréter un antibiogramme et proposer une conduite thérapeutique adaptée aux résultats obtenus. - Respecter les règles de biosécurité (niveau 2) et d’hygiène liées à la manipulation de spécimens potentiellement infectieux. **Prérequis :** - Connaissances de base en microbiologie générale (structure bactérienne, métabolisme, classification). - Maîtrise des règles d’asepsie et de la manipulation du matériel de verrerie stérile. - Notions d’hygiène hospitalière et de gestion des déchets biologiques dangereux (Décret n° 2005/084 du 12 mai 2005 portant réglementation de la gestion des déchets d’activités de soins au Cameroun). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les infections urinaires, diarrhéiques, respiratoires et septicémiques représentent une part importante de la morbidité, notamment chez les enfants de moins de cinq ans et les personnes vivant avec le VIH. Le laboratoire de microbiologie médicale joue un rôle central dans le diagnostic étiologique, permettant d’orienter la prescription antibiotique et de limiter l’émergence de résistances. Ce chapitre présente, de façon progressive, les procédures standardisées pour l’examen bactériologique des urines et des selles (Leçon 21) puis des crachats et du sang (Leçon 22), en insistant sur les aspects pratiques rencontrés en milieu de formation technique et professionnelle (stage en laboratoire hospitalier, unité de soins intensifs, centre de santé de district). --- ## I. Leçon 21 : Examens bactériologiques des urines et des selles ### A. Principes généraux L’analyse bactériologique des urines vise à détecter une bacteriurie significative (≥ 10⁵ UFC/mL) indicative d’une infection urinaire communautaire ou nosocomiale. Pour les selles, l’objectif est d’isoler les entéropathogènes (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Escherichia coli entérohémorragique, Vibrio cholerae) responsables de diarrées aiguës ou persistantes. > **UFC/mL** = unités formant des colonies par millilitre, unité de quantification du nombre de bactéries viables dans un liquide. ### B. Collecte et transport des échantillons | Type d’échantillon | Moment idéal de prélèvement | Contenant recommandé | Conditions de transport | |--------------------|----------------------------|----------------------|--------------------------| | Urine (mid‑stream) | Première miction du matin ou après 4 h de rétention | Flacon stérile à bouchon vissé, 30 mL, sans conservateur | Réfrigération à 2‑8 °C, analyse dans les 2 h ; sinon ajout d’acide borique (0,01 M) pour stabilisation jusqu’à 24 h | | Selles | Lors de l’émission diarrhéique, avant antibiothérapie | Pot en polypropylène stérile, 30‑60 mL, avec cuillère intégrée | Transporteur isotherme avec packs de glace, analyse dans les 6 h ; sinon mise en milieu de transport (Cary‑Blair) à 4 °C, stabilité 48 h | Le prélèvement doit être effectué après hygiène des mains et, pour l’urine, après nettoyage du méat urinaire avec une solution antiseptique (chlorhexidine 0,5 % ou povidone‑iodée 10 %). ### C. Méthodes de mise en culture 1. **Urine** : inoculation quantitative par boucle calibrée (1 µL) sur gélose cystine‑lactose‑électrolyte déficiente (CLED) et sur gélose sanguine (5 % sang de mouton). Incubation 24‑48 h à 37 °C en atmosphère aérobie. 2. **Selles** : pré‑enrichissement en milieu tamponné peptoné eau (BPW) 6 h à 37 °C, puis ensemencement sur milieux sélectifs : - Xylose lysine désoxycholate (XLD) pour Salmonella/Shigella - Campylobacter blood-free agar (CCDA) sous microaérophilie (5 % O₂, 10 % CO₂, 85 % N₂) - TCBS (thiosulfate‑citrate‑bile salts‑saccharose) pour Vibrio spp. Incubation 24‑48 h selon le milieu. ### D. Identification et antibiogramme - **Tests biochimiques rapides** : catalase, oxydase, urease, indole, production de H₂S (sur TSI), fermentation du lactose et du saccharose. - **Systèmes automatisés** (ex. VITEK 2, API 20E) utilisés dans les laboratoires de référence pour confirmer l’identité au niveau espèce. - **Antibiogramme** : méthode de diffusion sur agar (Kirby‑Bauer) selon les recommandations du CA-SFM 2024. Interprétation basée sur les critères CLSI/EUCAST adaptés aux pathogènes fréquents au Cameroun (E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. aureus, S. pyogenes). > *UFC/mL ≥ 10⁵* est considéré comme significatif pour une infection urinaire communautaire ; < 10⁵ UFC/mL peut refléter une contamination ou une colonisation. ### E. Interprétation des résultats - **Urine** : présence d’un seul type de colonie à ≥ 10⁵ UFC/mL associée à leucocyturie (> 10 cellules/µL) ou nitrités positifs → infection urinaire probable. Polymorphisme ou faible concentration → contamination. - **Selles** : isolement de Salmonella, Shigella, Campylobacter ou EHEC → étiologie bactérienne de la diarrhée. Absence de croissance malgré symptômes → envisager cause virale, parasitaire ou non infectieuse. ### F. Exemple d’atelier : calcul de la concentration bactérienne dans un échantillon d’urine Un élève prélève 1 mL d’urine qu’il dilue 1:100 (10 µL d’urine + 990 µL de sérum physiologique). Il ensemence 100 µL de cette dilution sur gélose CLED. Après incubation, il compte 45 colonies. Calcul : - Facteur de dilution total = 100 (pré‑dilution) × 10 (ensemencement de 100 µL sur 1 mL) = 1 000. - Nombre d’UFC dans le volume ensemencé = 45 colonies. - Concentration dans l’urine initiale = 45 × 1 000 = 45 000 UFC/mL. Résultat : 4,5 × 10⁴ UFC/mL < 10⁵ UFC/mL → bacteriurie non significative, probablement contamination. --- ## II. Leçon 22 : Examens bactériologiques des crachats et du sang ### A. Crachats #### 1. Collecte Le patient doit tousser profondément après rinçage buccal à l’eau stérile. Le recueil se fait dans un récipient stérile à couvercle vissé, idéalement tôt le matin avant repas ou antibiothérapie. Le volume minimal utile est de 2‑3 mL de matériel pur (pas de salive). > *Échantillon de crachat de qualité* : présence de leucocytes neutrophiles > 25 % et d’épithélium squameux < 10 % à l’examen microscopique de Gram. #### 2. Microscopie directe - **Coloration de Gram** : détection de leucocytes, de bactéries à Gram positif (ex. S. pneumoniae, S. aureus) ou à Gram négatif (ex. H. influenzae, K. pneumoniae). - **Coloration de Ziehl‑Neelsen** : recherche de bacilles acido‑résistants (BAR) pour Mycobacterium tuberculosis. Lecture après décoloration à l’acide alcoolique 3 % et contre‑coloration au bleu de méthylène. #### 3. Culture Ensemençage sur gélose sanguine (5 % sang) et gélose chocolatée (facteurs V et X) en atmosphère aérobie et 5 % CO₂ respectivement. Incubation 24‑48 h à 37 °C. Pour les BAR, milieu de Löwenstein‑Jensen ou MGIT 960 (système automatisé) avec incubation jusqu’à 6 semaines. #### 4. Identification - **Gram positif** : test de la coagulase (Staph. aureus), optochine (S. pneumoniae), bacitracine (S. pyogenes). - **Gram négatif** : oxydase (différencie Pseudomonas, Aeromonas), utilisation du lactose et du saccharose sur gélose MacConkey. - **BAR** : test de la niacinémie et du catalase pour différencier M. tuberculosis des mycobactéries non tuberculeuses. ### B. Sang #### 1. Principes de l’hémoculture L’hémoculture permet de détecter une bactériémie ou une fongémie. Le principe repose sur la dilution du sang dans un milieu liquide riche en facteurs de croissance, suivi d’une incubation agitée qui favorise la multiplication des micro‑organismes éventuellement présents. #### 2. Procédure de prélèvement - **Hygiène** : désinfection du site de ponction avec chlorhexidine 0,5 % + alcool 70 % (temps de séchage ≥ 30 s). - **Volume** : 20 mL de sang prélevé par ponction veineuse, réparti équitablement dans deux flacons hémoculture (aérobie et anaérobie) contenant respectivement 10 mL de milieu (ex. Bactec Plus Aerobic/FAN, Bactec Plus Anaerobic). - **Étiquetage** : numéro de patient, date, heure, type de flacon, nom du prélévateur. #### 3. Incubation et détection Les flacons sont placés dans un incubateur automatique (ex. Bactec FX) à 37 °C avec agitation continue. Le système surveille la production de CO₂ (indicateur de croissance) toutes les 10 min. Un signal positif déclenche une alerte et le passage à l’étape d’identification. #### 4. Identification et antibiogramme Dès la détection, un prélèvement du milieu positif est réalisé : - **Coloration de Gram** directe sur une goutte de milieu. - **Ensemençage** sur géloses appropriées (sanguine, chocolatée, MacConkey) selon le résultat de Gram. - **Tests biochimiques** ou système automatisé pour identification au niveau espèce. - **Antibiogramme** selon la même méthodologie que pour les urines, avec interprétation basée sur les critères EUCAST 2024 pour les isolats de sang (ex. S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, espèces de Streptocoques du groupe B). #### 5. Sécurité biologique Les manipulations d’hémoculture relèvent du **niveau de confinement 2 (BSL‑2)**. Les précautions obligatoires sont : - Port de gants nitrile, blouse à manches longues, protection oculaire (lunettes ou visière). - Utilisation d’une armoire de sécurité biologique (niveau 2) pour les ouvertures de flacons et les ensemencements. - Décontamination des surfaces avec solution d’hypochlorite à 0,5 % après chaque séance. - Élimination des déchets (flacons, pipettes, tampons) dans des conteneurs rigides étiquetés « déchets infectieux » conformément au décret camerounais sur la gestion des déchets d’activités de soins. > *Seuil de positivité* : une hémoculture est considérée comme significative lorsqu’au moins deux flacons (un aérobie et un anaérobie) deviennent positifs avec le même organisme, ou lorsqu’un seul flacon devient positif avec un pathogène connu pour être rarement contaminant (ex. S. aureus, S. pneumoniae). --- ## Synthèse du chapitre - **Objectif** : maîtriser les procédures de prélèvement, de mise en culture, d’identification et d’interprétation des résultats pour urines, selles, crachats et sang. - **Étapes clés** : 1. **Collecte** respectant les règles d’asepsie et les délais de transport. 2. **Microscopie directe** (Gram, Ziehl‑Neelsen) pour orientation présomptive. 3. **Culture** sur milieux sélectifs et différentiels adaptés à chaque spécimen. 4. **Identification** via tests biochimiques, systèmes automatisés et critères phénotypiques. 5. **Antibiogramme** selon Kirby‑Bauer, interprétation CA‑SFM/EUCAST. 6. **Biosécurité** : BSL‑2, EPI, armoire de sécurité, décontamination, gestion des déchets. - **Valeurs de référence** : - Urine : ≥ 10⁵ UFC/mL significatif. - Crachat de qualité : > 25 % neutrophiles, < 10 % épithélium squameux. - Hémoculture : positivité de deux flacons ou d’un pathogène strict. --- ## Glossaire - **UFC/mL** : unités formant des colonies par millilitre, mesure de la concentration bactérienne viable. - **CLED** : gélose cystine‑lactose‑électrolyte déficiente, milieu différentiel pour urines. - **XLD** : gélose xylose lysine désoxycholate, sélective pour Salmonella et Shigella. - **TCBS** : gélose thiosulfate‑citrate‑bile salts‑saccharose, sélective pour Vibrio spp. - **Ziehl‑Neelsen** : coloration spéciale pour détecter les bacilles acido‑résistants (Mycobacterium). - **Kirby‑Bauer** : méthode de diffusion sur agar pour tester la sensibilité aux antibiotiques. - **BSL‑2** : niveau de confinement biologique 2, adapté aux agents de risque modéré. - **Hémoculture** : culture du sang destinée à détecter une bactériémie ou fongémie. - **Milieu de transport (Cary‑Blair)** : solution préservant la viabilité des entéropathogènes pendant le transport. - **Optochine** : disque utilisé pour différencier Streptococcus pneumoniae des autres streptocoques. - **Coagulase** : enzyme produite par Staphylococcus aureus, mise en évidence par test de coagulation du plasma. - **Indole** : produit du métabolisme du tryptophane, détecté par le réactif de Kovács. --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Analyse d’un échantillon d’urine Un patient présente des brûlures mictionnelles. Un échantillon d’urine de 10 mL est recueilli, puis 1 mL est prélevé et dilué 1:10. 100 µL de cette dilution sont ensemencés sur gélose CLED. Après incubation, 78 colonies sont dénombrées. **Calcul** : - Facteur de dilution = 10 (pré‑dilution) × 10 (ensemencement de 100 µL sur 1 mL) = 100. - UFC dans l’urine initiale = 78 × 100 = 7 800 UFC/mL. **Interprétation** : 7,8 × 10³ UFC/mL < 10⁵ UFC/mL → bacteriurie non significative, probablement contamination ou colonisation faible. ### Exercice 2 – Identification d’un pathogène dans un crachat Un crachat de qualité montre à la coloration de Gram des cocci à Gram positif en paires et en chaînes courtes. Le test d’optochine donne une zone d’inhibition de 18 mm autour du disque. **Réponse** : Le résultat est caractéristique de *Streptococcus pneumoniae* (sensible à l’optochine). ### Exercice 3 – Détection d’une bactériémie Deux flacons d’hémoculture (aérobie et anaérobie) deviennent positifs après 12 h d’incubation. La coloration de Gram montre des bacilles à Gram négatif. L’ensemencement sur gélose MacConkey donne des colonies roses qui fermentent le lactose. Le test de l’oxydase est négatif. **Identification** : *Escherichia coli* (Gram négatif, lactose +, oxydase –). **Antibiogramme** (exemple) : - Amoxicilline‑clavulanate : zone 22 mm → sensible. - Ciprofloxacine : zone 28 mm → sensible. - Gentamicine : zone 20 mm → intermédiaire. **Conduite** : débuter une antibiothérapie à base d’amoxicilline‑clavulanate en attendant le résultat définitif de l’antibiogramme. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | Situation | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de sécurité / bonne pratique | |-----------|------------------|-------------|------------------------------------| | Prélèvement d’urine | Utilisation d’un récipient non stérile ou collecte après antibiothérapie | Faux‑négatif ou contamination | Toujours utiliser un flacon stérile, recueillir avant antibiothérapie, nettoyer le méat avec antiseptique. | | Transport des selles | Omission du milieu de transport (Cary‑Blair) lorsqu’il y a délai > 6 h | Mort des bactéries fragiles (ex. *Shigella*) | Utiliser Cary‑Blair ou maintenir à 4 °C et analyser dans les 6 h. | | Microscopie de Gram sur crachat | Lecture sans évaluer la qualité (trop de cellules épithéliales) | Interprétation erronée (colonisation orale) | Vérifier le ratio neutrophiles/épithélium squameux ; répéter le prélèvement si < 25 % neutrophiles. | | Ensemencement d’hémoculture | Ouverture des flacons hors armoire de sécurité biologique | Risque d’aérosolisation et contamination du personnel | Effectuer toutes les ouvertures et manipulations dans une armoire de classe II, porter EPI complet. | | Lecture d’antibiogramme | Interprétation d’une zone intermédiaire comme sensible sans ajustement de posologie | Sous‑dosage → échec thérapeutique | Suivre les recommandations du CA‑SFM : intermédiaire → considérer comme résistant ou ajuster dose selon pharmacocinétique. | | Gestion des déchets | Jet des flacons d’hémoculture usagés dans la poubelle ordinaire | Risque de blessure et de diffusion d’agents pathogènes | Déposer dans un conteneur rigide étiqueté « déchets infectieux », traiter par autoclave ou incinération selon la réglementation camerounaise. | --- *Fin du cours.*