Prélèvement et étude microscopique du sang

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de : 1. Réaliser un prélèvement sanguin veineux ou capillaire en respectant les règles d’asepsie et de sécurité biologique. 2. Préparer un frottis sanguin de qualité diagnostique (épaisseur, répartition, coloration). 3. Identifier au microscope optique les différentes cellules sanguines (hématies, leucocytes, plaquettes) et décrire leur morphologie normale. 4. Interpréter les résultats d’un hémogramme de base (numération, formule leucocytaire, hématocrite) dans un contexte pathologique fréquent au Cameroun (paludisme, anémie, infection bactérienne). **Prérequis** : connaissances de base en anatomie et physiologie du sang (composition, fonctions), notions d’hygiène hospitalière (lavage des mains, port des gants), utilisation du microscope optique (mise au point, objectifs, immersion). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les laboratoires de biologie médicale sont sollicités pour le dépistage du paludisme, le suivi des anémies liées à la carence en fer ou aux hémoglobinopathies, ainsi que le bilan immunologique des patients VIH. Un prélèvement sanguin bien réalisé et un frottis de qualité permettent d’obtenir des résultats fiables, essentiels pour orienter la prise en charge clinique. Ce chapitre présente les gestes techniques du prélèvement, de la préparation du frottis et de l’analyse microscopique, conformément au référentiel de compétences du MINESEC/IGE pour la série F7. --- ## I. Leçon 1 : Prélèvement du sang ### 1.1 Types de prélèvements - **Prélèvement veineux** : effectué au niveau de la veine cubitale médiane (coudé) ou, en seconde intention, des veines du dos de la main. Utilisé pour les examens nécessitant un volume suffisant (hémogramme, biochimie, sérologie). - **Prélèvement capillaire** : réalisé par puncture du bout du doigt (ou du talon chez le nourrisson) à l’aide d’une lancette stérile. Adapté aux tests rapides (glycémie, hémoglobine, dépistage du paludisme). ### 1.2 Matériel nécessaire | Élément | Spécificité | Usage | |---|---|---| | Aiguille à ailettes (papillon) | 21‑23 G, longueur 19 mm | Ponction veineuse | | Seringue stérile | 5 mL ou 10 mL | Aspiration du sang | | Tubes à anticoagulant | EDTA (violet) pour hémogramme, citrate bleu pour coagulation, sec (rouge) pour biochimie | Conservation de l’échantillon | | Garrot | élastique, latex‑free | Veine distension | | Alcool à 70 % | compresses stériles | Désinfection du site | | Compresses stériles | 5 × 5 cm | Compression post‑ponction | | Lancette stérile | 2 mm | Prélèvement capillaire | | Gants non stériles | taille adaptée | Protection du préleveur | | Conteneur DASRI | jaune, avec couvercle | Élimination des objets tranchants | ### 1.3 Procédure pas à pas (prélèvement veineux) 1. **Vérification de l’identité du patient** (nom, date de naissance, numéro de dossier). 2. **Explication du geste** et obtention du consentement verbal. 3. **Installation du patient** en position assise ou allongée, bras soutenu, manchette déboutonnée. 4. **Application du garrot** à 10‑15 cm au-dessus du site de ponction, sans trop serrer (éviter stase veineuse). 5. **Choix du site** : veine cubitale médiane visible et palpable. 6. **Désinfection** : mouvement circulaire de l’intérieur vers l’extérieur avec une compresse imbibée d’alcool, laisser sécher 30 s. 7. **Mise en place de l’aiguille** : biseau vers le haut, angle de 15‑30° par rapport à la peau, pénétration douce jusqu’à l’apparition du reflux de sang. 8. **Remplissage des tubes** : ordre de prélèvement recommandé (citrate → EDTA → sec) pour éviter la contamination croisée. Inverser légèrement le tube après chaque remplissage pour mélanger l’anticoagulant. 9. **Retrait de l’aiguille** : relâcher le garrot avant de retirer l’aiguille, appliquer immédiatement une compresse stérile sur le point de ponction. 10. **Compression** : maintenir une pression ferme pendant 2‑3 min afin d’éviter l’hématome. 11. **Étiquetage** : inscrire nom, prénom, date, heure, type de tube, et numéro d’ordre sur chaque tube immédiatement après le prélèvement. 12. **Élimination du matériel** : aiguille dans le conteneur DASRI, autres déchets dans le sac d’activités de soins à risque infectieux (DASRI). ### 1.4 Normes de sécurité et d’hygiène - Port obligatoire de gants non stériles, changement après chaque patient. - Utilisation d’aiguilles à sécurité rétractable quand disponibles. - Désinfection du plan de travail avec une solution chlorée à 0,5 % avant et après chaque série de prélèvements. - Vaccination anti‑hépatite B du personnel de laboratoire. - Gestion des déchets selon l’arrêté n° 2015/0012/MINSANTE du Cameroun (tri, stockage, incinération). ### 1.5 Exemple chiffré Un hémogramme complet nécessite 4 mL de sang anticoagulé EDTA. Un bilan biochimique (glycémie, créatinine) requiert 2 mL de sang sec chacun, soit 4 mL au total. Ainsi, pour un patient nécessitant les deux examens, le préleveur doit recueillir 8 mL au total, répartis comme suit : - Tube EDTA violet : 4 mL - Tube sec rouge : 4 mL > **>** *Règle de l’ordre de prélèvement* : toujours commencer par le tube de coagulation (citrate) pour éviter l’activation des facteurs de coagulation par l’EDTA. ### 1.6 Encadré à retenir > **>** *Première goutte* : en prélèvement capillaire, la première goutte de sang est éliminée car elle peut contenir de l’interstitiel ou du tissu cutané faussant le résultat. --- ## II. Leçon 2 : Identification des constituants du sang au microscope ### 2.1 Principe du frottis et de la coloration Le frottis sanguin permet d’étaler une fine couche de sang sur une lame afin d’obtenir une monocouche cellulaire. La coloration May‑Grünwald‑Giemsa (MGG) colore différentiellement le cytoplasme (bleu‑violet) et le noyau (rouge‑pourpre), facilitant la reconnaissance morphologique. ### 2.2 Constituants observés | Cellule | Diamètre moyen | Caractéristique quantitative | Particularités morphologiques | |---|---|---|---| | Hématie (érythrocyte) | 7‑8 µm | Hématocrite 40‑45 % du volume sanguin | Discoïde, biconcave, centre pâle, pas de noyau | | Neutrophile | 10‑12 µm | 50‑70 % des leucocytes | Nucléus polymorphique (2‑5 lobes), cytoplasme granulaire rose pâle | | Éosinophile | 10‑12 µm | 1‑4 % des leucocytes | Nucléus bilobé, granules gros rouges orangés | | Basophile | 10‑12 µm | 0‑1 % des leucocytes | Nucléus en S ou en C, granules gros bleu‑violet masquant le noyau | | Lymphocyte | 7‑10 µm | 20‑40 % des leucocytes | Nucléus rond, dense, cytoplasme étroit azur‑bleu | | Monocyte | 12‑15 µm | 2‑8 % des leucocytes | Nucléus en forme de rein ou de haricot, cytoplasme abondant gris‑bleu avec vacuoles | | Plaquette | 2‑3 µm | 150‑400 × 10⁹/L | Fragment cytoplasmique, granulaire violet, pas de noyau | ### 2.3 Morphologie normale (points clés à retenir) - **Hématie** : forme régulière, absence de inclusions, couleur uniforme gris‑rose. - **Leucocyte** : rapport noyau/cytoplasme élevé chez le lymphocyte, faible chez le neutrophil. Granulation spécifique selon le type. - **Plaquette** : apparence de petits disques violets, souvent en agrégats si le frottis est trop épais. ### 2.4 Tableau récapitulatif (encadré) > **>** *Formule leucocytaire* : pourcentage relatif des cinq types de leucocytes dans 100 cellules dénombrées. ### 2.5 Procédure d’observation au microscope 1. Placer la lame sur la platine, côté frottis vers le haut. 2. Commencer avec l’objectif 4× pour localiser une zone homogène (ni trop épaisse, ni trop fine). 3. Passer à l’objectif 10× puis 40× (sans immersion) pour repérer les cellules et ajuster la mise au point. 4. Passer à l’objectif 100× à immersion (huile de cèdre) : déposer une goutte d’huile sur la lame, descendre l’objectif jusqu’à contact, affiner la mise au point avec le vis micrométrique. 5. Effectuer le comptage selon la méthode de la bande : parcourir la lame en bandes parallèles, dénombrer 100 leucocytes et noter leur type. > **>** *Règle du comptage des plaquettes* : compter les plaquettes dans 10 champs à l’objectif 40× (sans immersion) ; la moyenne multipliée par 15 000 donne le nombre plaquettaire en ×10⁹/L. ### 2.6 Exemple chiffré : calcul de l’hématocrite à partir du volume globulaire Un prélèvement de 5 mL de sang donne, après centrifugation, un volume de globules rouges de 2 mL. \[ \text{Hématocrite (\%)} = \frac{\text{Volume des globules rouges}}{\text{Volume total du sang}} \times 100 = \frac{2}{5}\times100 = 40\% \] Un hématocrite de 40 % correspond à la limite inférieure de la normale chez l’adulte masculin (40‑50 %). > **>** *Valeur de référence de l’hématocrite* : homme 40‑50 %, femme 36‑46 %, enfant 30‑44 % (selon l’âge). --- ## III. Leçon 3 : Préparation d’un frottis sanguin ### 3.1 Matériel - Lame en verre propre, dégraissée (alcool 70 % puis séchage à l’air). - Goutte de sang total (anticoagulé EDTA ou capillaire). - Spreader (lamelle en verre ou plastique) avec bord biseauté. - Support de séchage (rack à l’abri de la poussière). - Méthanol pur (fixation). - Solution de coloration May‑Grünwald puis Giemsa (selon protocole du laboratoire). ### 3.2 Étapes de préparation 1. **Déposer la goutte** : 20 µL (environ une grosse goutte de sang) à 10 mm du bord de la lame. 2. **Positionner le spreader** : angle de 30° par rapport à la lame, bord en contact avec la goutte. 3. **Étaler** : pousser le spreader vers le opposé de la lame en un mouvement rapide et régulier ; la goutte s’étale en une langue de forme conique. 4. **Sécher à l’air** : laisser le frottis sécher complètement (5‑10 min) à l’abri du soleil et des courants d’air. 5. **Fixer** : tremper la lame dans le méthanol pur pendant 30 s, puis laisser sécher à l’air. 6. **Colorer** : couvrir la lame avec la solution May‑Grünwald pendant 3 min, rincer à l’eau distillée, couvrir avec la solution de Giemsa pendant 10‑12 min, rincer à nouveau, sécher à l’air. ### 3.3 Contrôle de qualité - **Épaisseur** : zone centrale doit présenter une monocellulaire, sans zones trop épaisses (amas de cellules) ni trop fines (absence de cellules). - **Répartition** : cellules bien séparées, pas d’agregats de plaquettes. - **Coloration** : noyau rouge‑pourpre, cytoplasme bleu‑violet pour les leucocytes, centre pâle des hématies. - **Absence de artefacts** : pas de bulles d’air, pas de traces de doigts. ### 3.4 Exemple chiffré : épaisseur théorique du frottis Volume de la goutte : 20 µL = 20 mm³. Surface de la lame utilisée : longueur 75 mm × largeur 25 mm = 1875 mm². Épaisseur moyenne si le liquide était uniformément réparti : \[ \text{Épaisseur} = \frac{\text{Volume}}{\text{Surface}} = \frac{20\text{ mm}^3}{1875\text{ mm}^2} \approx 0,0107\text{ mm} = 10,7\ \mu m \] Cette épaisseur correspond à environ 1 à 2 cellules superposées, idéale pour l’observation microscopique. > **>** *Angle du spreader* : maintenir un angle constant de 30° assure une épaisseur régulière et évite les traînées irrégulières. ### 3.5 Encadré à retenir > **>** *Temps de séchage* : un séchage insuffisant (< 2 min) entraîne une mauvaise fixation et une décoloration lors de la coloration Giemsa. --- ## Synthèse du chapitre - **Prélèvement** : choisir le type (veineux ou capillaire), préparer le matériel, suivre l’ordre des tubes, respecter l’asepsie et la sécurité (gants, élimination DASRI). - **Frottis** : déposer 20 µL de sang, étaler avec un spreader à 30°, sécher à l’air, fixer au méthanol, colorer MGG. - **Identification microscopique** : reconnaître hématies, neutrophiles, éosinophiles, basophiles, lymphocytes, monocytes, plaquettes ; connaître leurs tailles, pourcentages et particularités morphologiques. - **Contrôle de qualité** : épaisseur adéquate (~10 µm), répartition homogène, coloration nette, absence d’artefacts. - **Calculs usuels** : hématocrite = (V globules rouges / V total sang) × 100 ; numération plaquettaire = (moyenne plaquettes/10 champs) × 15 000. - **Sécurité** : port de gants, manipulation d’objets tranchants, vaccination anti‑HB, gestion des déchets selon la réglementation camerounaise. --- ## Glossaire | Terme | Définition | |---|---| | Anticoagulant | Substance qui empêche la coagulation du sang (ex. EDTA, citrate, héparine). | | Frottis sanguin | Fine couche de sang étalée sur une lame pour examen microscopique. | | Hématocrite | Pourcentage du volume sanguin occupé par les globules rouges. | | Formule leucocytaire | Répartition en pourcentage des différents types de leucocytes dans 100 cellules dénombrées. | | May‑Grünwald‑Giemsa (MGG) | Technique de coloration permettant de différencier noyau et cytoplasme des cellules sanguines. | | Spreader | Lamelle utilisée pour étaler la goutte de sang sur la lame afin d’obtenir un frottis uniforme. | | DASRI | Déchets d’activités de soins à risque infectieux (aiguilles, matériel souillé). | | Plaquette | Fragment cytoplasmique dérivé des mégacaryocytes, essentiel à la coagulation. | | Neutrophile | Leucocyte phagocytaire à noyau polymorphique, première ligne de défense bactérienne. | | Lymphocyte | Leucocyte responsable de l’immunité adaptatoire (humorale et cellulaire). | | Monocyte | Leucocyte précurseur des macrophages, impliqué dans la phagocytose et la présentation d’antigène. | | Éosinophile | Leucocyte granuleux impliqué dans la réponse aux parasites et les réactions allergiques. | | Basophile | Leucocyte rare libérant de l’histamine et de l’héparine lors des réactions allergiques. | | Hématie | Cellule érythrocytaire transportant l’oxygène, dépourvue de noyau chez le mammifère. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Prélèvement veineux **Situation** : Un patient de 28 ans se présente au laboratoire pour un bilan complet (hémogramme, glycémie, créatinine). Le préleveur dispose des tubes suivants : EDTA (violet), citrate (bleu), sec (rouge). **Consigne** : Décrire l’ordre de prélèvement, justifier chaque étape, et indiquer le volume prélevé dans chaque tube sachant que l’hémogramme nécessite 4 mL EDTA, la glycémie et la créatinine 2 mL chacun dans le tube sec. **Corrigé** : 1. **Ordre de prélèvement** : citrate → EDTA → sec. - Le citrate est prélevé en premier pour éviter que l’EDTA ne lie le calcium nécessaire à la coagulation lors du remplissage du tube citrate. - L’EDTA suit, car il est fortement chélateur et pourrait contaminer le tube suivant s’il était placé avant le citrate. - Enfin le tube sec, qui ne contient aucun additif, est prélevé en dernier afin d’éviter toute contamination par les anticoagulants. 2. **Volumes** : - Tube citrate : 1,5 mL (volume minimal pour un test de coagulation standard). - Tube EDTA : 4 mL (hémogramme complet). - Tube sec : 4 mL (2 mL pour glycémie, 2 mL pour créatinine). - Total prélevé : 9,5 mL. > **>** *Règle* : toujours respecter l’ordre citrate → EDTA → sec pour prévenir les interférences biochimiques. ### Exercice 2 – Identification au microscope **Situation** : Sur un frottis coloré MGG, l’étudiant observe les cellules suivantes dans 10 champs à l’objectif 40× : 12 neutrophiles, 4 lymphocytes, 2 monocytes, 1 éosinophile, 0 basophile, et compte en moyenne 8 plaquettes par champ. **Consigne** : Calculer la formule leucocytaire (en %) et estimer le nombre de plaquettes (×10⁹/L). **Corrigé** : - Total leucocytes dénombrés = 12+4+2+1+0 = 19. - Formule leucocytaire : - Neutrophiles = (12/19)×100 ≈ 63,2 % - Lymphocytes = (4/19)×100 ≈ 21,1 % - Monocytes = (2/19)×100 ≈ 10,5 % - Éosinophiles = (1/19)×100 ≈ 5,3 % - Basophiles = 0 % - Nombre de plaquettes : moyenne 8 plaquettes/champ × 15 000 = 120 000 plaquettes/µL = 120 × 10⁹/L. > **>** *Valeur de référence plaquettaire* : 150‑400 × 10⁹/L ; le résultat obtenu suggère une thrombopénie légère, à confirmer par un comptage en chambre de Neubauer ou un analyseur automatisé. ### Exercice 3 – Préparation d’un frottis **Situation** : Un technicien de laboratoire doit préparer un frottis à partir d’un prélèvement capillaire effectué au bout du doigt d’un enfant de 2 ans. Il ne dispose que d’une lame non dégraissée et d’un spreader en plastique. **Consigne** : Indiquer les étapes à suivre pour obtenir un frottis de qualité malgré le manque de dégraissage de la lame, et préciser les risques si la lame reste grasse. **Corrigé** : 1. **Dégrasage rapide** : passer la lame plusieurs fois avec une compresse imbibée d’alcool à 70 %, laisser sécher complètement avant de déposer la goutte de sang. 2. **Déposer la goutte** : 20 µL de sang capillaire (première goutte éliminée, deuxième goutte utilisée). 3. **Étaler** : placer le spreader à 30°, pousser en un mouvement régulier vers le opposé de la lame. 4. **Sécher à l’air** : 5‑10 min à l’abri de la poussière. 5. **Fixer** : immersion dans le méthanol pur 30 s, sécher à l’air. 6. **Colorer** : MGG selon protocole. **Risques si la lame reste grasse** : - Le sang ne s’étale pas uniformément, entraînant des zones épaisses (amas) et des zones trop fines (absence de cellules). - La fixation au méthanol est moins efficace, pouvant entraîner un décollement du frottis lors de la coloration. - La lecture microscopique devient difficile voire impossible, conduisant à un résultat non interprétable. > **>** *Astuce* : en l’absence de dégraisseur, un passage rapide à la flamme d’un brûleur Bunsen (pas plus de 2 s) peut éliminer les résidus gras, mais il faut éviter de chauffer excessivement la lame qui pourrait se fissurer. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | N° | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |---|---|---|---| | 1 | Oublier de retirer le garrot avant de retirer l’aiguille | Risque d’hématome important, douleur pour le patient | Toujours relâcher le garrot **avant** de retirer l’aiguille ; maintenir la compression après le retrait. | | 2 | Utiliser la première goutte de sang capillaire pour le dépistage du paludisme | Résultat faussement élevé ou faussement négatif à cause de l’interstitiel | Éliminer la première goutte, utiliser la deuxième goutte bien formée. | | 3 | Ne pas respecter l’ordre des tubes (EDTA avant citrate) | Inhibition de la coagulation dans le tube citrate (chélation du calcium), résultat de TP/INR faux (trop élevé) | Mémoriser l’ordre : citrate → EDTA → sec ; vérifier visuellement la couleur des bouchons avant prélèvement. | | 4 | Sécher le frottis à la lumière directe du soleil ou sous un ventilateur fort | Artefacts de décoloration, cellules déformées, mauvaise adhésion du colorant | Sécher à l’abri de la lumière et des courants d’air, sur un rack fermé ou dans un placard sombre. | | 5 | Négliger de porter des gants ou de les changer entre deux patients | Risque de contamination croisée (VIH, hépatites) et d’exposition du personnel | Porter des gants non stériles pour chaque prélèvement, les jeter immédiatement après usage dans le conteneur DASRI. | | 6 | Jeter l’aiguille usagée dans la poubelle ordinaire | Risque de piqûre accidentelle, transmission d’agents pathogènes | Déposer immédiatement l’aiguille dans un conteneur DASRI rigide, fermé et clairement signalé. |