Biotechnologie (partie 2/8)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Observer, isoler et identifier des microorganismes d’intérêt biotechnologique à l’aide de techniques de microscopie, de coloration et de tests biochimiques de base. - Réaliser les activités d’intégration qui permettent de mettre en relation les observations microscopiques avec les caractéristiques physiologiques des souches. - Préparer un inoculum pur, viable et quantifié selon les bonnes pratiques de laboratoire (BPL) et les normes d’hygiène camerounaises (arrêté n° 001/MINSANTE du 12 janvier 2018 relatif à la manipulation des agents pathogènes). - Appliquer les règles de sécurité biologique (niveau de confinement 1) et de gestion des déchets lors de la manipulation de cultures microbiennes. **Prérequis :** - Connaissances de base en cytologie cellulaire (structure procaryote/eucaryote). - Notions de stérilisation (autoclave, filtration, chaleur sèche) et de préparation de milieux de culture (agar, bouillon). - Maîtrise des règles de sécurité en laboratoire de biologie (port du blouse, gants, lunettes, lavage des mains). --- ## Introduction contextualisée La biotechnologie au Cameroun s’appuie de plus en plus sur l’exploitation locale de microorganismes pour la production d’aliments fermentés (comme le *bissap* (boisson fermentée d’hibiscus) et le *lait fermenté* (ex. yaourt local)), la dégradation des polluants organiques et la synthèse de composés à valeur ajoutée (enzymes, acides organiques). Pour transformer ces potentiels en procédés industriels fiables, il faut d’abord savoir **observer, identifier** les souches d’intérêt puis **préparer un inoculum** de qualité constante. Ce chapitre présente les méthodes de travail utilisées dans les laboratoires de recherche universitaire (Université de Yaoundé I, Institut de Recherche Agricole pour le Développement – IRAD) et dans les petites unités de transformation agroalimentaire du territoire national. --- ## I. Leçon 4 – Observation et identification de microorganismes d’intérêt biotechnologique ### A. Principes de l’observation microscopique 1. **Microscopie optique en champ clair** : grossissement 400‑1000×, illumination par lampe à tungstène. 2. **Préparation du frottis** : dépôt d’une goutte de suspension sur lame, étalement, fixation à la chaleur (passage rapide au flamme) ou à l’alcool 70 %. 3. **Coloration de Gram** : distingue les bactéries à paroi épaisse (Gram‑+) des parois fines (Gram‑‑). Réactifs : violet de cristal, lugol, décolorateur (alcool‑acétone), safranine. 4. **Coloration spéciale** : - *Coloration de Ziehl‑Neelsen* pour les bacilles acido‑résistants (ex. *Mycobacterium*). - *Coloration de négatif* (encre d’india) pour visualiser les capsules. > **>** La fixation à la chaleur détruit les enzymes pouvant altérer la morphologie ; elle doit être brève (2‑3 s) pour éviter la coagulation excessive des protéines. ### B. Identification morpho‑physiologique de base | Caractéristique | Observation | Test associé | Interprétation | |-----------------|-------------|--------------|----------------| | Forme (cocci, bacilles, spirilles) | Microscopie après coloration de Gram | – | Groupe taxonomique | | Disposition (chaînes, grappes, paires) | Microscopie | – | Genre probable | | Mobilité | Microscopie en contraste de phase ou hanging drop | – | Présence de flagelles | | Production de catalase | Bulle d’O₂ en ajoutant H₂O₂ 3 % | + = catalase+ | Differencie *Staphylococcus* (catalase+) de *Streptococcus* (catalase‑) | | Oxydase | Papier imbibé de tétraméthyl‑p‑phénylènediamine | + = oxydase+ | Typical de *Pseudomonas* | | Fermentation des sucres | Tubulure de Durham avec indicateur de pH (phénol rouge) | Production d’acide = jaune | Profil glucidique | | Production d’indole | Réaction de Kovacs après tryptophane | Anneau rouge = indole+ | *E. coli* typique | > **>** Le test de catalase est réalisé sur une lame propre ; une petite colonie est prélevée avec une boucle stérile et mélangée à une goutte de peroxyde d’hydrogène. L’apparition immédiate de bulles indique un résultat positif. ### C. Méthodes d’isolement et de purification 1. **Ensemencement en surface** (méthode de streaking) sur boîte de Pétri contenant un milieu sélectif (ex. agar MacConkey pour les entérobactéries Gram‑‑). 2. **Isolation par dilution en série** : préparation de suspensions 10⁻¹ à 10⁻⁶, ensemencement de 0,1 mL sur agar, comptage des colonies après incubation (24‑48 h à 30 °C ou 37 °C selon le groupe). 3. **Contrôle de pureté** : reprise d’une colonie isolée, nouvel ensemencement, vérification de l’uniformité morphologique après deuxième incubation. > **>** Le nombre de colonies comptées (CFU = Colony Forming Units) permet d’estimer la concentration initiale : N = (CFU comptés × facteur de dilution) / volume ensemencé (mL). ### D. Exemple chiffré d’identification (atelier laboratoire) Un échantillon de *bissap* (infusion d’hibiscus) est prélevé. Après ensemencement sur agar Mannitol‑Salt (sélectif pour *Staphylococcus*), on obtient 120 colonies à la dilution 10⁻⁴, volume ensemencé 0,1 mL. - Calcul : N = (120 × 10⁴) / 0,1 = 1,2 × 10⁷ CFU mL⁻¹. - Une colonie est sélectionnée : coloration de Gram → cocci à grappes, Gram‑+. - Test catalase → +, test coagulase → + (plasma rabbit agglutiné en 10 s). - Conclusion : isolation de *Staphylococcus aureus* potentiellement producteur d’entérotoxines → nécessite une étape de contrôle de sécurité avant toute utilisation biotechnologique. > **>** Toute isolation de pathogène potentiel doit être réalisée sous hotte de sécurité biologique de classe II, avec port de gants nitrile et lunettes de protection. ### E. Normes et règles de sécurité/hygiène pertinentes - Arrêté n° 002/MINSANTE du 15 février 2020 : classification des agents biologiques (groupe 2 = agents pouvant provoquer maladie humaine, risque modéré). - Décontamination des surfaces : ethanol 70 % ou solution d’hypochlorite de sodium 0,5 % (temps de contact 10 min). - Gestion des déchets : autoclavage à 121 °C, 15 min, pression 1,1 bar avant élimination en décharge spéciale. --- ## II. ACTIVITES D’INTEGRATION ### A. Objectif de l’activité Mettre en relation les données microscopiques, les résultats des tests biochimiques et les caractéristiques écologiques du milieu d’origine pour proposer une souche candidate à un procédé biotechnologique (ex. production d’acide lactique à partir de manioc). ### B. Démarche pas à pas 1. **Recueil des observations** : tableau récapitulatif (forme, disposition, Gram, mobilité, catalase, oxydase, fermentation des sucres). 2. **Interprétation taxonomique** : utilisation d’une clé dichotomique simplifiée (ex. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, édition 2012). 3. **Évaluation du potentiel technologique** : recherche bibliographique (articles camerounais, bases comme African Journals Online) sur la capacité de la souche à produire le métabolite d’intérêt. 4. **Rédaction d’un rapport d’intégration** : - Titre, contexte, méthodologie, résultats (tableaux et graphiques), discussion (pertinence du choix, limites), conclusion et perspectives. - Respect du format recommandé par le MINESEC (police Times New Roman 12, interligne 1,5, marges 2,5 cm). ### C. Exemple d’activité intégrée (atelier de transformation du manioc) - **Milieu d’origine** : effluent de fermentation du manioc (pH ≈ 4,5, riche en glucose). - **Observations** : bacilles courts, Gram‑+, catalase‑, oxydase‑, fermentation du glucose → production d’acide lactique (pH baisse à 3,8). - **Tests complémentaires** : production d’acide lactique dosée par titration avec NaOH 0,1 M (volume moyen 12,5 mL pour 10 mL de surnageant → 0,125 mol L⁻¹ d’acide lactique). - **Conclusion** : la souche appartient au genre *Lactobacillus* spp., candidat pour un démarreur de fermentation contrôlée du manioc afin d’améliorer la conservation et la valeur nutritionnelle. > **>** La titration d’acide lactique utilise l’indicateur phénolphtaleïne (pH 8,2‑10,0) ; le point d’équivalence correspond à une couleur rose pâle persistante pendant 30 s. ### D. Sécurité lors de l’activité - Manipulation des effluents : port de blouse à manches longues, gants résistants aux produits chimiques. - Décontamination des effluents avant rejet : traitement à la chaux vive (CaO) pour neutraliser l’acidité, suivi d’un temps de repos de 2 h. --- ## III. Leçon 5 – Préparation d’un inoculum ### A. Définition et critères de qualité d’un inoculum Un inoculum est une suspension de microorganismes vivants, homogène, dépourvue de contaminants, destinée à ensemencer un milieu de culture ou un fermenteur. Les critères essentiels sont : 1. **Viabilité** : pourcentage de cellules capables de former une colonie (> 90 % souhaité). 2. **Pureté** : absence de microbes étrangers vérifiée par contrôle microscopique et subculture sur milieu sélectif. 3. **Concentration connue** : généralement exprimée en UFC mL⁻¹ (Unités Formant des Colonies) ou en cellules mL⁻¹ mesurée par spectrophotométrie (OD₆₀₀). 4. **Stabilité physiologique** : cellules en phase exponentielle de croissance pour garantir une activité métabolique maximale. > **>** La phase exponentielle se reconnaît par une augmentation linéaire du logarithme du nombre de cellules en fonction du temps (pente constante sur un graphe log N vs t). ### B. Étapes de préparation d’un inoculum de bactérie lactique (ex. *Lactobacillus plantarum*) | Étape | Action | Détails techniques | Contrôle | |-------|--------|--------------------|----------| | 1. Pré‑culture | Ensemencer une colonie isolée dans 10 mL de bouillon MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) | Incubation 30 °C, 180 tr/min, 12‑16 h | Vérifier la turbidité (OD₆₀₀ ≈ 0,6‑0,8) | | 2. Dilution | Prélever 1 mL de pré‑culture, ajouter à 9 mL de bouillon MRS frais | Rapport 1:10 | Mélanger doucement pour éviter aération excessive | | 3. Culture de croissance | Incuber le flacon de dilution dans les mêmes conditions | Objectif : atteindre OD₆₀₀ ≈ 1,0 (phase exponentielle) | Mesurer OD toutes les 2 h | | 4. Récolte | Refroidir le flacon à 4 °C (arrêt de la croissance) | Centrifuger 5 000 g, 10 min, 4 °C | Décanter le surnavant | | 5. Lavage | Résuspension du pellet dans 10 mL de solution saline stérile (0,9 % NaCl) | Répéter 2 fois | Éliminer les résidus de milieu qui pourraient inhiber la fermentation | | 6. Ajustement de la concentration | Mesurer OD₆₀₀, diluer ou concentrer pour obtenir 1 × 10⁹ UFC mL⁻¹ (standard pour ensemencement 1 % v/v) | Utiliser la formule : C₁V₁ = C₂V₂ | Contrôler par comptage sur plaque (méthode de étalement) | | 7. Conditionnement | Aliquoter dans des tubes stériles de 10 mL, fermer avec bouchons à vis | Stocker à 4 °C (utilisation dans les 48 h) ou à –80 °C avec 15 % glycérol (conservation longue) | Vérifier l’absence de contamination par subculture sur MRS | > **>** Le facteur de dilution dépend de la souche ; pour *L. plantarum*, 1 OD₆₀₀ ≈ 1 × 10⁹ UFC mL⁻¹, donc si l’OD mesurée est différente de 1, on ajuste par dilution ou concentration selon le rapport C₁V₁ = C₂V₂. ### C. Méthodes de quantification de l’inoculum 1. **Comptage direct au compteur de cellules (hemocytomètre)** : - Dilution appropriée (ex. 1:100) dans du formol‑saline 0,5 % pour immobiliser les cellules. - Comptage des cellules dans les 4 grands carrés, moyenne, puis calcul : N = (moyenne × facteur de dilution × 10⁴) cellules mL⁻¹. 2. **Méthode de la plaque d’ensemencement (UFC)** : - Ensemencer 0,1 mL de dilutions successives (10⁻⁶ à 10⁻⁹) sur agar MRS en surface. - Incuber 30 °C, 48 h. - Choisir une plaque contenant entre 30 et 300 colonies. - Calcul : UFC mL⁻¹ = (nombre de colonies × facteur de dilution) / volume ensemencé (mL). > **>** Le choix de la dilution dépend de la concentration estimée ; il faut viser le comptage de 30‑300 colonies pour garantir une précision statistique (< 10 % d’erreur). ### D. Exemple chiffré de préparation d’un inoculum pour un fermenteur de 100 L (production d’acide lactique) Données : - Volume du fermenteur V_f = 100 L. - Taux d’ensemencement souhaité = 1 % v/v → volume d’inoculum V_i = 1 L. - Concentration cible de l’inoculum C_i = 1 × 10⁹ UFC mL⁻¹. **Étape 1 – Pré‑culture** : - Inoculer 10 mL de bouillon MRS avec une colonie isolée. - Incuber 30 °C, 180 tr/min, 12‑16 h. - OD₆₀₀ mesurée = 0,8 → concentration estimée = 0,8 × 1 × 10⁹ = 8 × 10⁸ UFC mL⁻¹ (en supposant 1 OD₆₀₀ ≈ 1 × 10⁹ UFC mL⁻¹ pour *L. plantarum*). **Étape 2 – Culture de croissance** : - Prélever 1 mL de la pré‑culture, ajouter 9 mL de MRS frais (dilution 1:10). - Incuber jusqu’à OD₆₀₀ = 1,0 → concentration = 1,0 × 1 × 10⁹ = 1 × 10⁹ UFC mL⁻¹. **Étape 3 – Ajustement (si nécessaire)** : - Si l’OD mesurée était, par exemple, 0,6 (concentration 6 × 10⁸ UFC mL⁻¹), on aurait besoin d’un facteur de concentration de (1 × 10⁹)/(6 × 10⁸) ≈ 1,67. - On pourrait alors centrifuger 600 mL de la culture, éliminer le surnavant et resuspended le pellet dans 360 mL de milieu frais (ou du sérum physiologique stérile) pour obtenir la concentration cible. **Étape 4 – Volume d’inoculum** : - Prélever 1 L de cette suspension et l’ajouter au fermenteur contenant 99 L de milieu de base (glucose 5 % w/v, sel minéral, pH réglé à 6,0 avec NaOH 1 N). > **>** Le contrôle de la température du fermenteur doit être maintenu à 37 ± 0,5 °C pendant la phase de croissance exponentielle (première 6 h) puis à 30 °C pour la phase de production d’acide lactique. ### E. Normes, règles de sécurité et bonnes pratiques de laboratoire (BPL) - **BPL** : traçabilité complète (date, opérateur, numéro de lot, conditions d’incubation, résultats des contrôles). - **Hygiène** : lavage des mains avant et après manipulation, désinfection du plan de travail avec éthanol 70 % avant chaque série d’opérations. - **Déchets** : les cultures usées sont autoclavées (121 °C, 15 min) avant élimination. Les pointes et pipettes utilisées sont placées dans des contenants perforés pour objets tranchants, puis autoclavées. - **Équipement de protection individuelle (EPI)** : blouse à manches longues, gants nitrile, lunettes de protection, masque anti‑aérosols si travail en hotte de classe II. - **Vérification de la stérilité** : témoin négatif (milieu non ensemencé) placé à côté de chaque série d’ensemencements ; aucune croissance après 48 h indique l’absence de contamination. --- ## Synthèse du chapitre - **Observation et identification** : microscopie optique, coloration de Gram et spéciales, tests biochimiques de base (catalase, oxydase, fermentation des sucres, indole). - **Activités d’intégration** : mise en relation des données morpho‑physiologiques avec le potentiel technologique, rédaction d’un rapport structuré selon les normes MINESEC. - **Préparation d’un inoculum** : critères de qualité (viabilité, pureté, concentration connue, phase exponentielle), procédé pas à pas (pré‑culture, dilution, culture de croissance, récolte, lavage, ajustement, conditionnement), méthodes de quantification (hemocytomètre, plaque d’ensemencement), exemple de dimensionnement pour un fermenteur de 100 L, règles de sécurité et BPL. > **>** La réussite d’un procédé biotechnologique dépend essentiellement de la qualité de l’inoculum : une suspension non pure ou sous‑viable entraîne des retards de croissance, des contaminations et une baisse du rendement du produit cible. > **>** Toute manipulation de microorganismes doit être réalisée sous hotte de sécurité biologique de classe II, avec port d’EPI adapté et décontamination des déchets par autoclave. > **>** Le nombre de colonies comptées (UFC) permet de remonter à la concentration initiale grâce à la formule N = (CFU comptés × facteur de dilution) / volume ensemencé. > **>** La phase exponentielle de croissance se caractérise par une augmentation linéaire du log du nombre de cellules versus le temps ; c’est le stade optimal pour prélever un inoculum destiné à la production industrielle. --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | **UFC** | Unité Formant des Colonies, mesure du nombre de cellules viables capables de former une colonie sur un milieu solide. | | **OD₆₀₀** | Densité optique mesurée à une longueur d’onde de 600 nm, utilisée pour estimer la concentration cellulaire en suspension. | | **Phase exponentielle** | Stade de croissance où le nombre de cellules augmente de façon exponentielle (double à chaque génération). | | **Hémocytomètre** | Dispositif de verre comportant une grille connue permettant le comptage direct des cellules sous microscope. | | **Coloration de Gram** | Technique de différenciation des bactéries selon la composition de leur paroi peptidoglycanique (Gram‑+ vs Gram‑‑). | | **Milieu sélectif** | Milieu de culture contenant des inhibiteurs qui permettent la croissance uniquement de certains groupes de microorganismes. | | **Inoculum** | Suspension de microorganismes préparée pour ensemencer un milieu de culture ou un fermenteur. | | **Autoclave** | Appareil de stérilisation à vapeur sous pression (121 °C, 1,1 bar) utilisé pour détruire tous les formes de vie microbienne. | | **Hotte de sécurité biologique de classe II** | Poste de travail à flux d’air laminaire qui protège l’opérateur, l’environnement et le produit des aerosols microbiologiques. | | **BPL** | Bonnes Pratiques de Laboratoire, ensemble de règles garantissant la traçabilité, la reproductibilité et la sécurité des expérimentations. | | **Décontamination** | Processus visant à éliminer ou inhiber les microorganismes sur des surfaces ou dans des déchets (ex. autoclave, désinfectants chimiques). | | **Titre d’acide lactique** | Concentration d’acide lactique exprimée en grammes par litre ou en moles par litre, déterminée par titration. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Calcul de concentration d’un inoculum **Situation** : Vous avez préparé une pré‑culture de *Lactobacillus casei* dans 10 mL de bouillon MRS. Après 16 h d’incubation à 30 °C, l’OD₆₀₀ mesurée est de 0,5. Sachant que pour cette souche 1 OD₆₀₀ ≈ 1,8 × 10⁸ UFC mL⁻¹, quelle est la concentration de la pré‑culture ? Vous devez préparer un inoculum de 500 mL à 2 × 10⁹ UFC mL⁻¹ pour ensemencer un fermenteur de 25 L (2 % v/v). Quel volume de pré‑culture devez‑vous prélever et quel volume de milieu frais devez‑vous ajouter pour atteindre la concentration cible ? **Corrigé** : 1. Concentration pré‑culture = 0,5 × 1,8 × 10⁸ = 9,0 × 10⁷ UFC mL⁻¹. 2. Volume d’inoculum nécessaire V_i = 2 % × 25 L = 0,5 L = 500 mL (comme demandé). 3. Pour obtenir une concentration plus élevée que celle de la pré‑culture, il faut **concentrer** les cellules, et non simplement diluer. - Nombre total de cellules requis = C_cible × V_i = 2 × 10⁹ UFC mL⁻¹ × 500 mL = 1,0 × 10¹² UFC. - Volume de pré‑culture nécessaire = (nombre total de cellules) / C_pré = 1,0 × 10¹² UFC / 9,0 × 10⁷ UFC mL⁻¹ ≈ 1,11 × 10⁴ mL ≈ 11,1 L. - Ainsi, il faudrait produire environ 11 L de pré‑culture, puis la concentrer (par centrifugation et resuspended dans 500 mL de milieu frais) pour obtenir l’inoculum souhaité. - À l’échelle de laboratoire, on augmenterait plutôt l’OD de la pré‑culture (par exemple en la laissant atteindre OD₆₀₀ ≈ 5,5) avant la récolte, ou on réaliserait une étape de concentration intermédiaire. **Réponse** : Pour atteindre 2 × 10⁹ UFC mL⁻¹ dans 500 mL, il faut concentrer les cellules ; prélever directement un volume de pré‑culture et ajouter du milieu frais ne permettrait pas d’augmenter la concentration. On doit donc produire un volume suffisant de pré‑culture (≈ 11 L à l’OD mesurée) puis le concentrer jusqu’à 500 mL. ### Exercice 2 – Détermination du nombre de générations **Situation** : Une culture de *Bacillus subtilis* débute à 1 × 10⁶ UFC mL⁻¹ et atteint 6,4 × 10⁹ UFC mL⁻¹ après 5 h d’incubation en conditions optimales. Calculer le nombre de générations (n) et le temps de génération (g). **Corrigé** : - n = log₂(N_f / N_i) = log₂(6,4 × 10⁹ / 1 × 10⁶) = log₂(6400) ≈ log₁₀(6400)/log₁₀(2) ≈ (3,806)/0,301 ≈ 12,64 générations. - g = durée totale / n = 5 h / 12,64 ≈ 0,395 h ≈ 23,7 min. **Réponse** : environ 12,6 générations, temps de génération ≈ 24 min. ### Exercice 3 – Interprétation d’un antibiogramme (simulé) **Situation** : Après identification d’une bactérie Gram‑‑ isolée d’un échantillon d’eau de rivière, vous réalisez un test de sensibilité à la pénicilline G (disque de 10 UI). Le diamètre de la zone d’inhibition mesuré est de 6 mm. Le critère de sensibilité pour cet antibiotique chez les entérobactéries est : ≥ 13 mm sensible, 8‑12 mm intermédiaire, ≤ 7 mm résistant. Quelle est votre interprétation ? Quelle mesure de préconiseriez‑vous pour éviter la propagation de cette souche dans un procédé de traitement des eaux usées ? **Corrigé** : Le diamètre de 6 mm ≤ 7 mm → la souche est **résistante** à la pénicilline G. Pour limiter sa diffusion, il convient d’appliquer un traitement de désinfection terminal (ex. chloration à 20 mg L⁻¹ pendant 30 min ou irradiation UV à 40 mJ cm⁻²) avant le rejet ou la réutilisation de l’eau traitée. ### Exercice 4 – Préparation d’un milieu sélectif **Situation** : Vous devez préparer 500 mL d’agar Mannitol‑Salt (MSA) pour isoler des *Staphylococcus* à partir d’un échantillon de fromage artisanal. La formule du MSA (pour 1 L) est : peptone 10 g, extrait de levure 5 g, chlorure de sodium 75 g, mannite 10 g, phénol rouge 0,025 g, agar 15 g, eau distillée q.s.p. 1 L. **Corrigé** : - Pour 500 mL, diviser chaque masse par 2 : peptone 5 g, extrait de levure 2,5 g, NaCl 37,5 g, mannite 5 g, phénol rouge 0,0125 g, agar 7,5 g, eau distillée jusqu’à 500 mL. - Dissoudre les solides dans ~450 mL d’eau chaude, porter à ébullition, ajouter l’agar, maintenir l’ébullition 1 min pour solubiliser, puis ajuster le volume à 500 mL avec de l’eau stérile. - Stériliser à l’autoclave 121 °C, 15 min, refroidir à 45‑50 °C, verser dans des boîtes de Pétri stériles, laisser solidifier. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | N° | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |----|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Oublier de flamer la boucle entre deux prélèvements | Contamination croisée, faux‑positifs | Flamer la boucle jusqu’à rouge vif avant chaque prélèvement et laisser refroidir quelques secondes sur le milieu stérile. | | 2 | Utiliser un milieu non stérilisé pour la préparation d’un inoculum | Proliferation de contaminants, échec du procédé | Vérifier l’indicateur de stérilité (bande autoclavante) avant chaque utilisation ; réaliser un témoin de stérilité (milieu non ensemencé). | | 3 | Négliger le refroidissement de la culture avant centrifugation | Lyse des cellules, perte de viabilité | Placer le tube sur glace ou dans un réfrigéré à 4 °C pendant 5‑10 min avant centrifugation. | | 4 | Effectuer des dilutions à l’œil nu sans utiliser de pipettes graduées | Erreurs de facteur de dilution, concentration d’inoculum hors spécification | Utiliser des pipettes volumétriques calibrées, vérifier le volume délivré par pesée (1 mL d’eau ≈ 1 g). | | 5 | Manipuler des cultures potentiellement pathogènes hors hotte de classe II | Exposition de l’opérateur, risque d’infection | Toujours travailler dans une hotte de sécurité biologique de classe II, porter EPI complet, réaliser la décontamination des surfaces après chaque manipulation. | | 6 | Jeter les déchets liquides non traités dans l’évier | Contamination de l’environnement, risque sanitaire | Autoclaver les déchets liquides (ou ajouter un désinfectant chimique adéquat) avant élimination conforme à la réglementation camerounaise (arrêté n° 002/MINSANTE). | --- *Fin du cours.*