Techniques sérologiques (partie 1/3)

## Objectifs et prérequis **À la fin de ce chapitre, l’élève sera capable de :** - Décrire le principe, le matériel et les étapes de l’immunodiffusion simple et double en gel. - Expliquer le fonctionnement de l’immunofluorescence directe et indirecte, ainsi que les précautions liées à l’utilisation de fluorochromes. - Présenter le principe du test ELISA (enzyme‑linked immunosorbent assay), ses variantes (direct, indirect, sandwich, compétitif) et réaliser le calcul d’une concentration à partir d’une courbe d’étalonnage. - Appliquer les règles de sécurité biologique (niveau de confinement 2) et d’hygiène de laboratoire lors de la manipulation d’échantillons sérologiques. - Interpréter les résultats obtenus (présence/absence de précipité, intensité de fluorescence, valeur d’absorbance) et en tirer une conclusion diagnostique ou de recherche. **Prérequis :** - Notions d’immunité humorale (anticorps, antigène, complexe immun). - Connaissances de base en biochimie des protéines (solubilité, précipitation). - Manipulation de micropipettes, lecture de spectrophotomètre et préparation de tampons (PBS, Tris‑HCl). - Règles de bonne pratique de laboratoire (BPL) et port des EPI (gants, blouse, lunettes de protection). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les laboratoires de biologie médicale des hôpitaux de référence (Yaoundé, Douala, Garoua) réalisent quotidiennement des tests sérologiques pour le diagnostic du VIH, de l’hépatite B, de la fièvre typhoïde ou encore de la brucellose. Les techniques sérologiques permettent de détecter la présence d’anticorps spécifiques ou d’antigènes dans le sérum du patient, en s’appuyant sur la formation de complexes immun visibles ou mesurables. Ce chapitre présente les trois premières méthodes du programme officiel : l’immunodiffusion (visualisation directe du précipité), l’immunofluorescence (détection par fluorescence) et le test ELISA (quantification enzymatique). Chacune de ces techniques trouve une application concrète en milieu hospitalier ou en laboratoire de recherche : contrôle de la qualité des vaccins, suivi sérologique des campagnes de vaccination, dépistage de maladies infectieuses en zone rurale, etc. --- ## I. Leçon 13 : Immunodiffusion ### 1. Principe L’immunodiffusion repose sur la migration d’un antigène et d’un anticorps dans un gel (généralement de l’agarose à 1 % ou du polyacrylamide) où ils forment un complexe immun insoluble qui précipite sous forme de bande visible. La vitesse de diffusion dépend de la taille moléculaire et de la concentration des réactifs. > **> Principe de base** : Lorsque l’antigène et l’anticorps se rencontrent dans des proportions d’équivalence, un réseau de complexes immun se forme et précipite, donnant une ligne de précipitation nette. ### 2. Types d’immunodiffusion | Type | Description | Application typique | |------|-------------|---------------------| | **Simple (Ouchterlony)** | Un puits central contient l’anticorps, les puits périphériques contiennent différents antigènes. | Détection de la spécificité croisée entre antigènes (ex. : différenciation de souches de *Salmonella*). | | **Double (radiale)** | L’antigène est diffusé dans le gel à partir d’un puits central, l’anticorps est présent uniformément dans le gel. | Quantification d’un antigène (ex. : dosage de l’IgG sérique). | | **En électrophorèse (immunoélectrophorèse)** | Combinaison d’électrophorèse et d’immunodiffusion sur gel d’agarose. | Analyse de protéines plasmatiques (ex. : recherche de bandes monoclonales). | ### 3. Matériel et réactifs - Gel d’agarose 1 % préparé dans du tampon PBS (pH 7,4). - Plaque de verre ou de plastique avec puits (diamètre 2–3 mm, profondeur 4 mm). - Micropipettes réglables (0,5–10 µL). - Antigène purifié (ex. : protéine de surface du VIH gp120) à concentration connue. - Anticorps polyclonal ou monoclonal adapté. - Chambre humide pour éviter la déshydratation du gel. - Lampe de lumière blanche ou transilluminateur pour lecture des précipités. ### 4. Protocole pas à pas (immunodiffusion simple) 1. **Préparation du gel** : Faire fondre 1 g d’agarose dans 100 mL de PBS bouillant, refroidir à 55 °C, verser 10 mL dans la plaque, laisser solidifier 20 min. 2. **Création des puits** : À l’aide d’un poinçon, réaliser un puits central (3 mm) et six puits périphériques équidistants (4 mm du centre). 3. **Dépôt des réactifs** : - Puits central : 5 µL d’anticorps à 1 mg/mL. - Puits périphériques : 5 µL de chaque antigène à tester (dilution 1 : 100 dans PBS). 4. **Incubation** : Couvrir la plaque d’un couvercle humide, incuber à 20–22 °C pendant 18–24 h. 5. **Lecture** : Observer les lignes de précipitation sous lumière transmise. Une ligne nette indique une réaction d’équivalence ; une ligne floue ou absente indique un excès ou un défaut de spécificité. 6. **Enregistrement** : Photographier le gel, noter la position et l’intensité de chaque ligne. ### 5. Exemple chiffré (calcul de la concentration d’antigène) Supposons que la ligne de précipitation apparaît entre le puits d’anticorps (Cₐ = 1 mg/mL) et le puits d’antigène inconnu. La distance du centre au précipité est de 8 mm, tandis que la distance du puits d’antigène au précipité est de 4 mm. En supposant une diffusion linéaire, le rapport des concentrations est égal au rapport inverse des distances : \[ \frac{C_{Ag}}{C_{Ab}} = \frac{d_{Ab}}{d_{Ag}} = \frac{8\text{ mm}}{4\text{ mm}} = 2 \] Donc \[ C_{Ag} = 2 \times C_{Ab} = 2 \times 1\text{ mg/mL} = 2\text{ mg/mL} \] > **> Formule de dilution en immunodiffusion** : \(C_{Ag}=C_{Ab}\times\frac{d_{Ab}}{d_{Ag}}\) ### 6. Normes de sécurité et d’hygiène - Manipuler les antigènes pathogènes (ex. : VIH, HBV) sous hotte de sécurité biologique de classe II (BSL‑2). - Porter gants nitrile, blouse à manches longues et protection oculaire. - Décontaminer la surface de travail avec une solution d’hypochlorite à 0,5 % après chaque séance. - Éliminer les gels usagés dans des conteneurs de déchets infectieux (jaunes). --- ## II. Leçon 14 : Immunofluorescence ### 1. Principe L’immunofluorescence utilise un anticorps marqué par un fluorochrome (ex. : FITC, PE, APC) qui émet de la lumière lorsqu’il est excité par une longueur d’onde spécifique. Le complexe antigène‑anticorps fluorescent est visualisé au microscope à fluorescence ou au lecteur de plaques. > **> Définition** : Fluorochrome = molécule capable d’absorber de la lumière à une longueur d’onde donnée et de la réémettre à une longueur d’onde plus longue (fluorescence). ### 2. Types d’immunofluorescence | Type | Description | Avantages / Limites | |------|-------------|---------------------| | **Directe** | Anticorps primaire directement conjugué au fluorochrome. | Rapide, moins de étapes, mais sensibilité moindre (un seul fluorochrome par complexe). | | **Indirecte** | Anticorps primaire non marqué + anticorps secondaire marqué (anti‑IgG). | Amplification du signal (plusieurs fluorochromes par antigène), mais risque de réaction croisée. | | **Compétitive** | Antigène marqué en compétition avec l’antigène échantillon pour l’anticorps. | Utilisé pour le dosage d’antigènes faibles. | ### 3. Matériel et réactifs - Lames de verre propres, traitées à la poly-L-lysine pour améliorer l’adhérence cellulaires. - Tampon de blocage (PBS + 3 % BSA ou sérum bovin). - Anticorps primaire spécifique (ex. : anti‑HBc IgG) à 1 µg/mL. - Anticorps secondaire marqué FITC (anti‑IgG humain) à 2 µg/mL. - Fluorochrome de contrôle (ex. : DAPI pour le noyau). - Microscope à fluorescence avec filtres d’excitation/émission adaptés (FITC : ex 488 nm, em 520 nm). - Chambre humide, pincettes, pipettes. ### 4. Protocole pas à pas (immunofluorescence indirecte sur cellules fixes) 1. **Fixation** : Laisser les cellules sur lame dans du formol à 4 % pendant 10 min à température ambiante, puis rincer 2× PBS. 2. **Perméabilisation** (si l’antigène est intracellulaire) : Tremper dans 0,1 % Triton X‑100 pendant 5 min, rincer. 3. **Blocage** : Couvrir la lame avec 200 µL de solution de blocage (PBS + 3 % BSA) pendant 30 min à 37 °C. 4. **Incubation avec l’anticorps primaire** : Déposer 100 µL d’anticorps primaire dilué (1 µg/mL) dans le blocage, incuber 1 h à 37 °C ou toute nuit à 4 °C. 5. **Lavage** : 3× 5 min PBS avec agitation douce. 6. **Incubation avec l’anticorps secondaire marqué** : 100 µL d’anticorps secondaire FITC (2 µg/mL) dans le blocage, 45 min à l’abri de la lumière à 37 °C. 7. **Lavage** : 3× 5 min PBS, protéger de la lumière. 8. **Coloration du noyau (optionnel)** : 5 µL de DAPI (1 µg/mL) pendant 5 min, rincer. 9. **Montage** : Déposer une goutte de mounting medium antifade, couvrir avec une lamelle, sceller aux bords avec du vernis à ongles si nécessaire. 10. **Acquisition** : Observer au microscope à fluorescence, capturer les images (ex. : canal vert pour FITC, bleu pour DAPI). ### 5. Exemple chiffré (calcul du rapport signal/bruit) Supposons que l’intensité moyenne de fluorescence mesurée dans la région d’intérêt (ROI) soit \(I_{ROI}= 1500\) unités arbitraires (UA) et celle du fond (background) soit \(I_{bg}= 200\) UA. \[ \text{Rapport signal/bruit (S/B)} = \frac{I_{ROI}}{I_{bg}} = \frac{1500}{200}=7,5 \] Un S/B > 5 est généralement considéré comme bon pour une détection fiable. > **> Formule du rapport signal/bruit** : \(S/B = \frac{I_{signal}}{I_{fond}}\) ### 6. Normes de sécurité et d’hygiène - Travailler sous hotte de sécurité biologique (BSL‑2) lors de la manipulation de sérums potentiellement infectieux. - Porter lunettes de protection contre les éclats de fluorochrome (certaines sont phototoxiques). - Éviter l’exposition prolongée aux UV du microscope ; utiliser des filtres de protection si nécessaire. - Éliminer les lames utilisées dans des conteneurs de déchets tranchants et infectieux. - Stocker les anticorps marqués à –20 °C, à l’abri de la lumière, dans des tubes opaques. --- ## III. Leçon 15 : Test ELISA : principe ### 1. Principe général L’ELISA (Enzyme‑Linked Immunosorbent Assay) repose sur l’immobilisation d’un antigène ou d’un anticorps sur une plaque de polystyrène à 96 puits, suivie d’une détection enzymatique qui produit un signal colorimétrique mesurable par spectrophotométrie à une longueur d’onde spécifique (souvent 450 nm). L’intensité du signal est proportionnelle à la quantité d’analyte présent dans l’échantillon. > **> Définition** : ELISA = technique d’immuno‑adsorption enzymatique permettant la quantification ou la détection qualitative d’un antigène ou d’un anticorps. ### 2. Variantes principales | Variante | Schéma d’immobilisation | Détection | Utilisation typique | |----------|------------------------|-----------|---------------------| | **ELISA direct** | Antigène adsorbé sur puits | Anticorps primaire marqué par enzyme | Détection rapide d’antigène (ex. : protéine virale). | | **ELISA indirect** | Antigène adsorbé | Anticorps primaire non marqué + anticorps secondaire marqué | Dosage d’anticorps sériques (ex. : anti‑VIH). | | **ELISA sandwich** | Anticorps de capture adsorbé | Antigène échantillon + anticorps de détection marqué | Dosage d’antigène soluble (ex. : cytokine IL‑6). | | **ELISA compétitif** | Antigène adsorbé | Antigène échantillon en compétition avec antigène marqué | Dosage d’hormones de petite taille (ex. : cortisol). | ### 3. Matériel et réactifs - Plaque ELISA à 96 puits (polystyrène, surface hydrophile). - Tampon de revêtement (carbonate‑bicarbonate pH 9,6). - Tampon de blocage (PBS + 1 % lait écrémé ou BSA). - Tampon de lavage (PBS + 0,05 % Tween‑20). - Antigène ou anticorps de capture (concentration optimale déterminée par titration). - Anticorps de détection marqué par une enzyme (HRP – peroxydase de raifort, ou ALP – phosphatase alcaline). - Substrat chromogène (ex. : TMB – 3,3′,5,5′‑tétraméthylbenzidine pour HRP). - Solution d’arrêt (acide sulfurique 2 M) pour bloquer la réaction. - Lecteur de plaques à 450 nm (avec référence à 620 nm pour correction du fond). - Micropipettes multicanaux, plateau de mélange, incubateur à 37 °C. ### 4. Protocole pas à pas (ELISA indirect pour dosage d’anticorps anti‑VIH) 1. **Revêtement** : Déposer 100 µL d’antigène VIH (gp120) à 5 µg/mL dans chaque puits, incuber 1 h à 37 °C ou toute nuit à 4 °C. 2. **Lavage** : 3× 200 µL de tampon de lavage, tapoter la plaque sur papier absorbant. 3. **Blocage** : Ajouter 200 µL de tampon de blocage (PBS + 1 % lait), incuber 1 h à 37 °C. 4. **Lavage** : répéter l’étape 3. 5. **Incubation des échantillons** : Ajouter 100 µL de sérum dilué (1 : 100 dans tampon de dilution) dans les puits d’échantillon, puits négatif (diluent seul) et puits positif (contrôle connu). Incuber 1 h à 37 °C. 6. **Lavage** : répéter l’étape 3. 7. **Anticorps secondaire marqué** : Déposer 100 µL d’anticorps anti‑IgG humain conjugué à HRP (dilution 1 : 5000), incuber 45 min à 37 °C. 8. **Lavage** : répéter l’étape 3. 9. **Ajout du substrat** : Verser 100 µL de solution TMB dans chaque puits, incuber 15–20 min à l’abri de la lumière (la couleur bleue apparaît). 10. **Arrêt de la réaction** : Ajouter 50 µL d’acide sulfurique 2 M, la couleur passe du bleu au jaune. 11. **Lecture** : Mesurer l’absorbance à 450 nm (référence 620 nm) avec le lecteur de plaques. ### 5. Exemple chiffré (construction d’une courbe d’étalonnage et calcul de concentration) On prépare une série de dilutions d’un contrôle positif d’anticorps anti‑VIH (concentration connue) : 0, 10, 20, 40, 80, 160 UI/mL. Après lecture, on obtient les absorbances suivantes (moyenne de triplicats) : | Concentration (UI/mL) | Absorbance (A₄₅₀) | |-----------------------|-------------------| | 0 | 0,050 | | 10 | 0,120 | | 20 | 0,210 | | 40 | 0,380 | | 80 | 0,620 | | 160 | 0,950 | On trace A₄₅₀ en fonction de la concentration et on ajuste une droite linéaire dans l’intervalle 0–80 UI/mL (où la réponse est linéaire) : \[ A = m \cdot C + b \] En utilisant les points (0, 0,050) et (80, 0,620) : \[ m = \frac{0,620-0,050}{80-0}= \frac{0,570}{80}=0,007125\; \text{A·mL/UI} \] \[ b = 0,050 \] Ainsi, l’équation de la courbe est : \[ A = 0,007125\,C + 0,050 \] Un échantillon patient donne une absorbance de 0,460. On calcule sa concentration : \[ C = \frac{A - b}{m}= \frac{0,460-0,050}{0,007125}= \frac{0,410}{0,007125}\approx 57,5\; \text{UI/mL} \] > **> Formule de quantification ELISA** : \(C = \frac{A - b}{m}\) où \(A\) = absorbance mesurée, \(b\) = ordonnée à l’origine, \(m\) = pente de la courbe d’étalonnage. ### 6. Normes de sécurité et d’hygiène - Manipuler les sérums provenant de patients sous hotte de sécurité biologique (BSL‑2). - Porter gants, blouse et lunettes ; éviter les aérosols lors du pipetage. - Décontaminer les plaques utilisées avec une solution d’hypochlorite à 0,5 % avant élimination dans les déchets infectieux. - Respecter les temps d’incubation et les températures prescrites pour éviter la dégradation des enzymes (HRP perd son activité au-delà de 40 °C). - Utiliser des pointes de pipette filtrées pour prévenir la contamination croisée entre puits. --- ## Synthèse du chapitre - **Immunodiffusion** : migration d’antigène/anticorps dans un gel → précipité visible ; types : simple (Ouchterlony), double (radiale), immunoélectrophorèse ; lecture de lignes de précipitation ; formule de dilution \(C_{Ag}=C_{Ab}\times\frac{d_{Ab}}{d_{Ag}}\). - **Immunofluorescence** : anticorps marqué par fluorochrome → émission de lumière après excitation ; directe vs indirecte ; protocole de fixation, blocage, incubation primaire/secondaire, lavage, montage ; rapport signal/bruit \(S/B = \frac{I_{signal}}{I_{fond}}\). - **ELISA** : immobilisation sur plaque, détection enzymatique, lecture spectrophotométrique ; variantes : direct, indirect, sandwich, compétitif ; protocole de revêtement, blocage, incubation, lavage, substrat, arrêt ; quantification via courbe d’étalonnage : \(C = \frac{A-b}{m}\). - **Sécurité** : travail en BSL‑2, port d’EPI, décontamination à l’hypochlorite 0,5 %, gestion des déchets infectieux, protection contre les UV et les produits chimiques. --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | Antigène | Molécule capable de déclencher une réponse immunitaire spécifique, reconnue par un anticorps. | | Anticorps | Immunoglobuline produite par les lymphocytes B, capable de se lier spécifiquement à un antigène. | | Complexe immun | Association non covalente d’un antigène avec son anticorps correspondant. | | Précipité | Phase solide insoluble résultant de l’agglomération de complexes immun dans un milieu aqueux. | | Gel d’agarose | Matrice polysaccharide utilisée pour la diffusion d’antigènes et d’anticorps en immunodiffusion. | | Fluorochrome | Molécule fluorescente qui absorbe de la lumière à une longueur d’onde donnée et la réémet à une longueur d’onde plus longue. | | Immunofluorescence directe | Technique où l’anticorps primaire est déjà conjugué à un fluorochrome. | | Immunofluorescence indirecte | Technique utilisant un anticorps secondaire marqué pour détecter un anticorps primaire non marqué. | | ELISA | Enzyme‑Linked Immunosorbent Assay, méthode d’immuno‑adsorption enzymatique pour la détection ou la quantification d’un antigène/anticorps. | | HRP | Peroxydase de raifort, enzyme fréquemment utilisée comme marqueur en ELISA pour sa réaction avec le substrat TMB. | | TMB | 3,3′,5,5′‑tétraméthylbenzidine, substrat chromogène de l’HRP produisant une couleur bleue puis jaune après arrêt. | | Courbe d’étalonnage | Relation entre la concentration d’un étalon connu et le signal mesuré (absorbance, fluorescence), utilisée pour quantifier les échantillons inconnus. | | BSL‑2 | Niveau de confinement de sécurité biologique 2, adapté aux agents pathogènes de risque modéré (ex. : VIH, HBV). | | Tampon de blocage | Solution contenant des protéines non spécifiques (BSA, lait) qui saturent les sites de liaison non spécifiques sur la plaque ou le gel. | | Rapport signal/bruit (S/B) | Ratio entre l’intensité du signal spécifique et celle du fond, indicateur de la qualité de la détection. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Immunodiffusion (situation de laboratoire) **Consigne** : Dans un laboratoire de référence de Yaoundé, vous devez vérifier la spécificité croisée entre deux antigènes de *Salmonella* (AgA et AgB) en utilisant une immunodiffusion simple (Ouchterlony). Vous disposez d’un anticorps polyclonale anti‑*Salmonella* à 2 mg/mL. Après incubation de 20 h, vous observez une ligne de précipitation nette entre le puits d’anticorps et le puits d’AgA, mais aucune ligne entre le puits d’anticorps et le puits d’AgB. **Questions** : a) Interprétez ces résultats en termes de spécificité antigénique. b) Proposez une modification du protocole pour améliorer la détection d’une éventuelle faible réaction croisée avec AgB. **Corrigé** : a) La présence d’une ligne nette avec AgA indique que l’anticorps reconnaît spécifiquement cet antigène. L’absence de ligne avec AgB suggère soit que l’anticorps ne reconnaît pas d’épitopes communs à AgB, soit que la concentration d’AgB est insuffisante pour atteindre la zone d’équivalence. b) Pour augmenter la sensibilité, on peut : - Augmenter la quantité d’AgB déposée (passer de 5 µL à 10–20 µL ou augmenter sa concentration). - Réduire la concentration d’anticorps dans le puits central (par exemple à 0,5 mg/mL) afin de déplacer la zone d’équivalence vers les puits périphériques. - Allonger le temps d’incubation à 30–48 h à température ambiante, permettant une diffusion plus complète. - Réaliser une immunodiffusion en double diffusion (antigène dans le gel, anticorps dans les puits) pour améliorer la détection des antigènes de faible affinité. ### Exercice 2 – Immunofluorescence (situation de terrain) **Consigne** : Un centre de dépistage du paludisme à Garoua utilise une immunofluorescence indirecte pour détecter les anticorps anti‑*Plasmodium falciparum* sur des lames de sang fixe. Après lecture au microscope, vous obtenez les valeurs suivantes d’intensité de fluorescence (UA) pour trois puits : témoin négatif = 150, témoin positif (contrôle connu à 100 UI/mL) = 820, échantillon patient = 560. **Questions** : a) Calculez le rapport signal/bruit (S/B) pour l’échantillon patient. b) En supposant une réponse linéaire entre 0 et 100 UI/mL, estimez la concentration d’anticorps dans l’échantillon patient. **Corrigé** : a) S/B = \( \frac{I_{patient}}{I_{neg}} = \frac{560}{150} \approx 3,73 \). b) Tout d’abord, déterminons la pente de la courbe d’étalonnage entre le négatif (0 UI/mL, 150 UA) et le positif (100 UI/mL, 820 UA) : \[ m = \frac{820-150}{100-0}= \frac{670}{100}=6,7\; \text{UA·mL/UI} \] L’ordonnée à l’origine \(b\) est l’intensité du négatif : 150 UA. La concentration estimée : \[ C = \frac{I_{patient}-b}{m}= \frac{560-150}{6,7}= \frac{410}{6,7}\approx 61,2\; \text{UI/mL} \] ### Exercice 3 – ELISA (situation de laboratoire de transfusion) **Consigne** : Au centre national de transfusion sanguine de Douala, vous réalisez un ELISA indirect pour détecter les anticorps anti‑HCV chez des donneurs. La courbe d’étalonnage construite avec un étalon positif (anti‑HCV) donne l’équation : \(A = 0,0045\,C + 0,030\) (A en absorbance à 450 nm, C en UI/mL). Un échantillon de donneur donne une absorbance de 0,210. **Questions** : a) Déterminez la concentration d’anticorps anti‑HCV dans l’échantillon. b) Si le seuil de positivité est fixé à 10 UI/mL, l’échantillon est‑il considéré comme positif ou négatif ? Justifiez. **Corrigé** : a) En résolvant l’équation pour C : \[ C = \frac{A - 0,030}{0,0045}= \frac{0,210-0,030}{0,0045}= \frac{0,180}{0,0045}= 40\; \text{UI/mL} \] b) La concentration obtenue (40 UI/mL) dépasse largement le seuil de 10 UI/mL ; l’échantillon est donc **positif** pour les anti‑HCV. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | # | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |---|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Oublier de bloquer la plaque ELISA avant l’ajout des échantillons | Liaison non spécifique → faux positifs élevés | Toujours réaliser l’étape de blocage (PBS + 1 % lait ou BSA) et vérifier l’absence de couleur dans les puits négatifs avant de poursuivre. | | 2 | Utiliser une concentration d’anticorps trop élevée en immunodiffusion | Précipitation diffuse, lignes floues, difficulté d’interprétation | Effectuer une titration préalable de l’anticorps (ex. : 0,1, 0,5, 1, 2 mg/mL) et choisir la concentration qui donne des lignes nettes sans diffusion excessive. | | 3 | Omettre de protéger les lames d’immunofluorescence de la lumière après ajout du fluorochrome | Blanchiment du signal (photoblanchisme) → sous‑estimation | Réaliser les incubations secondaires à l’abri de la lumière, utiliser des tubes et des boîtes opaques, et limiter l’exposition au microscope à la durée strictement nécessaire. | | 4 | Ne pas changer de pointe entre deux échantillons différents en ELISA | Contamination croisée → résultats faux positifs ou négatifs | Utiliser des pointes filtrées et changer de pointe à chaque transfert ; si des pointes multicanaux sont utilisées, rincer la manche entre les plaques. | | 5 | Manipuler des sérums potentiellement infectieux sans hotte de sécurité biologique | Risque d’exposition au pathogène (VIH, HBV, HCV) | Toujours travailler dans une hotte de classe II (BSL‑2) ; porter gants nitrile, blouse à manches longues et protection oculaire ; décontaminer les surfaces avec hypochlorite 0,5 % après chaque séance. | | 6 | Utiliser un substrat TMB périmé ou mal conservé | Faible ou absence de développement de couleur → faux négatifs | Vérifier la date de péremption, conserver le substrat à 4 °C à l’abri de la lumière, et réaliser un test de contrôle positif avant chaque série d’essais. | --- *Fin du cours.*