modern Biotechnology

# modern Biotechnology ## Objectifs et prérequis **Objectifs :** - Définir les termes fondamentaux de la biotechnologie moderne. - Expliquer la production de l'insuline humaine par biotechnologie. - Décrire l'utilisation de la levure dans la production de bière, de vin et de pain. - Expliquer la production du yaourt par fermentation bactérienne. - Décrire le principe et les applications de l'empreinte ADN (DNA fingerprinting). - Appliquer ces connaissances à des exercices concrets. **Prérequis :** - Connaissances de base en biologie cellulaire (ADN, ARN, protéines, enzymes). - Notions de génétique (transcription, traduction, plasmide). - Compréhension de la fermentation anaérobie. - Notions de base en microbiologie (bactéries, levures). --- ## I. Notion of basic terminologies used in biotechnology ### Définitions clés > **Biotechnology** : L'application d'organismes vivants, de leurs parties ou de leurs produits pour modifier des produits ou des processus destinés à un usage spécifique. > **Recombinant DNA technology** : Technique permettant de combiner de l'ADN provenant de deux sources différentes in vitro et de l'introduire dans un organisme hôte pour qu'il soit exprimé. > **Plasmid** : Molécule d'ADN extracromosomique, généralement circulaire, présente chez certaines bactéries, capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien. > **Cloning vector** : Molécule d'ADN (souvent un plasmide) utilisée pour transporter un fragment d'ADN étranger dans une cellule hôte. > **Expression system** : Système biologique (bactérie, levure, cellule mammalienne) utilisé pour produire une protéine d'intérêt à partir d'un gène introduit. > **Fermentation** : Processus métabolique anaérobie où des microorganismes convertissent des substrats organiques (comme le sucre) en produits tels que l'alcool, l'acide lactique ou le dioxyde de carbone, générant de l'ATP sans oxygène. ### Exemples résolus **Exemple 1 : Identification d'un plasmide de clonage** Un plasmide pBR322 contient deux gènes de résistance aux antibiotiques : *ampR* (résistance à l'ampicilline) et *tetR* (résistance à la tétracycline). Si un fragment d'ADN humain est inséré dans le gène *tetR*, quelle sera la phénotype des bactéries transformées sur un milieu contenant de l'ampicilline mais pas de tétracycline ? - **Solution** : L'insertion dans *tetR* inactivera ce gène → perte de résistance à la tétracycline. Le gène *ampR* reste intact → résistance à l'ampicilline conservée. Les bactéries transformées seront donc **ampicilline-résistantes, tétracycline-sensibles**. **Exemple 2 : Choix d'un système d'expression** Pour produire une protéine humaine nécessitant des modifications post-traductionnelles (comme la glycosylation), quel système d'expression serait le plus approprié parmi *E. coli*, levure (*Saccharomyces cerevisiae*) et cellules de mammifères ? - **Solution** : *E. coli* ne réalise pas de glycosylation eucaryote. La levure effectue une glycosylation, mais différente de celle des mammifères (risque d'immunogénicité). Les cellules de mammifères (ex. : cellules CHO) réalisent des glycosylations proches de l'humain. Donc, **cellules de mammifères** sont préférées. ### Exercices d'application corrigés **Exercice 1** Un chercheur veut cloner le gène de l'insuline humaine dans un plasmide. Il utilise un plasmide contenant un gène de résistance à la kanamycine (*kanR*) et un site de clonage dans le gène *lacZ* (codant pour la β-galactosidase). Après transformation, il plaque les bactéries sur un milieu contenant de la kanamycine et du X-gal. a) Quel sera le phénotype des bactéries ayant réussi l'insertion du gène d'insuline ? b) Pourquoi utilise-t-on le X-gal ? **Corrigé** a) L'insertion dans *lacZ* inactivera ce gène → pas de β-galactosidase fonctionnelle → pas d'hydrolyse du X-gal → colonies **blanches** (au lieu de bleues). Elles seront aussi **kanamycine-résistantes** (gène *kanR* intact). b) Le X-gal est un substrat chromogène : hydrolyse par la β-galactosidase → produit bleu. Son utilisation permet un **sélection bleu-blanc** : colonies bleues = pas d'insertion ; colonies blanches = insertion réussie. **Exercice 2** Dans un vecteur d'expression, le promoteur *lac* est utilisé pour contrôler l'expression d'un gène étranger. Pourquoi ajoute-t-on de l'IPTG dans le milieu de culture ? **Corrigé** L'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) est un analogue de l'allolactose qui se lie au répresseur Lac, provoquant un changement conformationnel qui empêche sa liaison à l'opérateur. Cela **dérépresse** le promoteur *lac*, permettant la transcription du gène étranger. L'IPTG n'est pas métabolisé, donc l'induction est stable. --- ## II. Applications of biotechnology: in 1) production of human insulin ### Contexte historique Avant les années 1980, l'insuline utilisée pour traiter le diabète était extraite du pancréas de porcs ou de vaches. Cette insuline animale provoquait parfois des réactions immunitaires chez les patients. La biotechnologie a permis de produire une **insuline humaine identique** à celle sécrétée par le pancréas humain. ### Étapes de la production de l'insuline humaine par biotechnologie 1. **Isolation du gène de l'insuline humaine** - L'ADNm codant pour l'insuline est extrait des cellules β du pancréas humain. - Par transcription inverse (reverse transcriptase), on obtient l'ADN complémentaire (cDNA) du gène de l'insuline. - Le cDNA contient les séquences pour la préproinsuline (signal peptide + chaîne B + peptide C + chaîne A). 2. **Clonage dans un vecteur d'expression** - Le cDNA de l'insuline est inséré dans un plasmide d'expression (ex. : pBR322 modifié) sous le contrôle d'un promoteur bactérien fort (ex. : promoteur *lac* ou *trp*). - Le plasmide est introduit dans *Escherichia coli* par transformation. 3. **Expression et formation de corps d'inclusion** - Après induction (ex. : avec IPTG), la bactérie produit la préproinsuline humaine. - En raison de la différence d'environnement cellulaire, la préproinsuline s'agrège en **corps d'inclusion** (agrégats protéiques insolubles) dans le cytoplasme. 4. **Purification et refolding** - Les corps d'inclusion sont lysés et la préproinsuline est purifiée par chromatographie. - Elle est ensuite dénaturée (ex. : avec urée) et réduite (ex. : avec DTT) pour briser les liaisons disulfure incorrectes. - Par dialyse lente contre un tampon contenant de l'oxygène réduit, les chaînes A et B se réassocient correctement, formant les **liaisons disulfure natives** (entre Cys A7-Cys B7, A20-B19, A6-A11). 5. **Élimination du peptide C** - La préproinsuline subit deux coupures protéolytiques : d'abord suppression du signal peptide, puis excision du peptide C par des protéases spécifiques (ex. : trypsine-like), laissant uniquement la chaîne A et la chaîne B liées par des ponts disulfure. 6. **Formulation finale** - L'insuline humaine pure est formulée en solution injectable (ex. : avec zinc pour former des hexamères stables) ou en poudre lyophilisée. ### Schéma simplifié $$ \text{ADN humain (insuline)} \xrightarrow{\text{Reverse transcriptase}} \text{cDNA} \xrightarrow{\text{Clonage dans plasmide}} \text{Plasmid recombinant} \xrightarrow{\text{Transformation}} E. coli \xrightarrow{\text{Induction}} \text{Préproinsuline} \xrightarrow{\text{Corps d'inclusion}} \xrightarrow{\text{Purification + Refolding}} \text{Insuline humaine} $$ ### Avantages de l'insuline recombinante - Identique à l'insuline humaine → moindre risque d'immunogénicité. - Production illimitée et standardisée. - Absence de contaminants animaux. - Possibilité de produire des analogues (ex. : insuline lispro, aspart) avec propriétés pharmacocinétiques modifiées. ### Exercices d'application corrigés **Exercice 1** Pourquoi la préproinsuline produite par *E. coli* forme-t-elle des corps d'inclusion plutôt qu'une protéine soluble et fonctionnelle ? **Corrigé** *E. coli* manque des mécanismes de chaperonines et de l'environnement oxydant du réticulum endoplasmique nécessaires au pliement correct et à la formation des liaisons disulfure natives. La préproinsuline humaine, riche en cystéines, forme donc des agrégats insolubles (corps d'inclusion) où les liaisons disulfure sont incorrectes ou non spécifiques. **Exercice 2** Dans la production de l'insuline recombinante, pourquoi utilise-t-on de l'urée et du DTT lors du refolding ? **Corrigé** L'urée est un agent dénaturant qui détruit les interactions non covalentes (liaisons hydrogène, hydrophobes), permettant de séparer les chaînes polypeptidiques. Le DTT (dithiothréitol) est un agent réducteur qui brise les liaisons disulfure incorrectes formées dans les corps d'inclusion. Ensemble, ils permettent d'obtenir une chaîne polypeptidique réduite et dénaturée, sur laquelle un refolding contrôlé peut reformer les **bonnes** liaisons disulfure (A7-B7, A20-B19, A6-A11) en présence d'oxygène réduit (équilibre oxydo-réducteur). **Exercice 3** Un patient diabétique développe une réaction allergique à l'insuline porcine mais tolère bien l'insuline humaine recombinante. Expliquez cette différence immunologique. **Corrigé** L'insuline porcine diffère de l'insuline humaine par un seul acide aminé : à la position B30, l'alanine chez l'humain est remplacée par une thréonine chez le porc. Cette différence, bien que minime, peut être suffisante pour être reconnue comme un épitope étranger par le système immunitaire de certains patients, déclenchant une réponse IgE-mediated ou une réaction inflammatoire. L'insuline humaine recombinante, étant identique à l'endogène, n'est pas reconnue comme antigène. --- ## III. Use of yeast in: beer, and wine production, baking ### Généralités sur la levure > **Yeast (levure)** : Microorganisme eucaryote unicellulaire appartenant au règne des champignons. *Saccharomyces cerevisiae* est l'espèce la plus utilisée en biotechnologie alimentaire. Elle réalise la fermentation alcoolique : conversion du glucose en éthanol et dioxyde de carbone sous conditions anaérobie. $$ \text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 \xrightarrow{\text{Levure}} 2\,\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\,\text{CO}_2 + \text{énergie (2 ATP)} $$ Cette réaction est catalysée par deux enzymes clés : - **Pyruvate décarboxylase** : convertit le pyruvate en acétaldéhyde + CO₂. - **Alcool déshydrogénase** : réduit l'acétaldéhyde en éthanol en utilisant le NADH comme donneur d'électrons (régénérant le NAD⁺ pour permettre la poursuite de la glycolyse). --- ### 1. Production de bière #### Processus de brassage 1. **Mouture** : Les grains d'orge (maltés) sont broyés pour exposer l'amidon. 2. **Empâtage** : Le malt est mélangé à de l'eau chaude (60–70°C) → les enzymes (α- et β-amylases) hydrolyse l'amidon en maltose et glucose → **moût**. 3. **Filtrage** : séparation du liquide (moût) des résidus solides (drêches). 4. **Ébullition** : Le moût est bouilli avec ajout de houblon (pour l'amertume, l'arôme et la conservation). 5. **Refroidissement** : Le moût est refroidi à ~20°C. 6. **Fermentation** : Ajout de levure (*Saccharomyces cerevisiae* pour les ales, *S. pastorianus* pour les lagers). - Fermentation primaire : 3–10 jours → production d'éthanol et CO₂. - Fermentation secondaire (maturation) : semaines à mois → clarification et développement des arômes. 7. **Conditionnement** : Ajout éventuel de sucre et de levure pour refermentation en bouteille (production naturelle de CO₂). 8. **Filtration et pasteurisation** (optionnel) : pour stabilité. #### Types de bière selon la levure - **Ales** : fermentées à haute température (15–24°C) par *S. cerevisiae* → fermentation rapide, arômes fruités. - **Lagers** : fermentées à basse température (7–13°C) par *S. pastorianus* (hybride) → fermentation lente, goût plus net et pur. #### Exercice corrigé **Exercice** Lors de la fabrication de la bière, pourquoi l'étape d'ébullition du moût est-elle cruciale avant la fermentation ? **Corrigé** L'ébullition sert à : 1. Stériliser le moût (éliminer les microorganismes indésirables). 2. Inactiver les enzymes du malt (arrêter la dégradation de l'amidon à un profil souhaité). 3. Extraire et isomeriser les acides alpha du houblon en composés amers (isohumulones). 4. Faire évaporer des composés volatils indésirables (comme le diméthylsulfure, DMS). Sans ébullition, le risque de contamination microbiologique est élevé et le profil gustatif serait déséquilibré. --- ### 2. Production de vin #### Processus de vinification 1. **Vendange** : récolte des raisins. 2. **Égrappage et foulage** : séparation des rafles, écrasement des baies pour libérer le jus (moût). 3. **Fermentation alcoolique** : - Peut être **indigène** (levures naturelles présentes sur la peau du raisin ou dans l'environnement) ou **ensemencée** (ajout de souches sélectionnées de *Saccharomyces cerevisiae*). - Température contrôlée : blancs (12–18°C), rouges (25–30°C pour extraire tanins et couleur). - Durée : 5–15 jours. - Le CO₂ produit peut être libéré (cuves ouvertes) ou retenu (pression modérée). 4. **Pressurage** (pour les rouges) : séparation du vin libre du marc après fermentation. 5. **Fermentation malolactique** (optionnelle, surtout pour les rouges et certains blancs) : conversion de l'acide malique en acide lactique + CO₂ par des bactéries lactiques (*Oenococcus oeni*) → diminution de l'acidité, arrondi du goût. 6. **Élevage** : élevage en cuve ou en fût de chêne (apport de tanins, vanilline, notes toastées). 7. **Clarification** : collage (bentonite, blanc d'œuf), filtration. 8. **Mise en bouteille** : éventuellement ajout de SO₂ (antioxydant et antimicrobien). #### Rôle de la levure - Production d'éthanol et de CO₂. - Production de composés aromatiques : esters (acétate d'éthyle → odeur de banane), alcools supérieurs, thiols (arômes de fruit de la passion, buis). - Influence sur le pH et la stabilité du vin. #### Exercice corrigé **Exercice** Dans la vinification des vins blancs, pourquoi contrôle-t-on strictement la température de fermentation (souvent entre 12 et 18°C) ? **Corrigé** Une température de fermentation trop élevée (>20°C) entraîne : - Une production accrue d'alcools supérieurs et d'acétate (goût de solvant, de vernis). - Une volatilisation excessive des arômes délicats (thiols, esters fruités). - Un risque de production de composés sulfurés désagréables (comme le sulfure d'hydrogène, H₂S, odeur d'œuf pourri). Une température basse préserve les arômes fruités et floraux, favorise une fermentation lente et régulière, et améliore la qualité aromatique du vin blanc. --- ### 3. Baking (production de pain) #### Processus de panification 1. **Pétrissage** : mélange de farine, d'eau, de sel et de levure (*Saccharomyces cerevisiae*) → formation du réseau de gluten (glutenine + gliadine). 2. **Première fermentation (pointage)** : repos de 1–2 heures à température ambiante → la levure fermente les sucres présents dans la farine (glucose, maltose provenant de l'action de l'amylase sur l'amidon) → production de CO₂. - Le CO₂ est piégé par le réseau élastique de gluten → formation de bulles → augmentation du volume de la pâte. 3. **Dégazage** : la pâte est aplatie pour redistribuer la levure et les sucres, et éliminer les grosses bulles. 4. **Façonnage** : la pâte est donnée sa forme finale (baguette, boule, etc.). 5. **Deuxième fermentation (apprêt)** : repos de 30–90 minutes → nouvelle production de CO₂ → détente finale de la pâte avant cuisson. 6. **Cuisson** : à ~200–250°C → - Tue la levure (~60°C). - Gélifie l'amidon (60–70°C). - Coagule les protéines du gluten. - Développe la croûte par réaction de Maillard et caramélisation. - Évapore l'alcool et une partie de l'eau. - Fixation de la structure du pain. #### Rôle de la levure - Production de CO₂ → levée de la pâte (alvéolage). - Production d'alcool → évaporé lors de la cuisson, contribue à l'arôme. - Production de composés organiques volatils (acétaldéhyde, etc.) qui influencent le goût et l'odeur du pain. - Activation de certaines enzymes (protéases, amylases) par légère acidification (production d'acide carbonique à partir du CO₂ dissous). #### Exercice corrigé **Exercice** Pourquoi la pâte à pain ne lève-t-elle pas si l'on oublie d'ajouter du sel, même si la levure est présente et active ? **Corrigé** Le sel joue plusieurs rôles essentiels : 1. **Régule l'activité de la levure** : en absence de sel, la levure consomme les sucres trop rapidement → épuisement prématuré du réservoir énergétique → arrêt de la production de CO₂ avant la fin de l'apprêt. 2. **Renforce le réseau de gluten** : le sel resserre les liaisons électrostatiques entre les chaînes de glutenine, rendant le réseau plus élastique et résistant à la déformation → meilleure rétention du gaz. 3. **Contrôle l'activité enzymatique** : inhibe certaines protéases qui pourraient dégrader excessivement le gluten. Sans sel, la pâte devient trop extensible, manque de ténacité, les bulles de CO₂ fusionnent et s'échappent → pain plat, dense, avec une mie irrégulière. --- ## IV. Yoghurt production ### Contexte > **Yogourt (yaourt)** : Produit laitier fermenté obtenu par l'action de bactéries lactiques spécifiques sur le lait, entraînant l'acidification du lait et la coagulation des protéines (principalement la caséine). ### Bactéries utilisées > **Starter culture** : Mélange symbiotique de deux bactéries : > - *Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus* > - *Streptococcus thermophilus* Ces deux espèces sont **thermophiles** (optimum de croissance autour de 42–45°C) et travaillent en synergie : - *S. thermophilus* croît d'abord, acidifie légèrement le lait et produit de l'acide formique et de l'acide folique, stimulant la croissance de *L. bulgaricus*. - *L. bulgaricus* dégrade les protéines du lait en peptides et acides aminés, fournissant des facteurs de croissance à *S. thermophilus*. - Ensemble, elles produisent de l'acide lactique (principalement L(+)–acide lactique) à partir du lactose du lait. ### Processus de fabrication 1. **Standardisation du lait** : ajustement du taux de matière grasse et/ou des protéines (ex. : ajout de lait écrémé en poudre) pour obtenir une texture souhaitée. 2. **Chauffage (pasteurisation)** : le lait est chauffé à 85–95°C pendant 10–30 minutes → - Élimine les microorganismes pathogènes et altérateurs. - Dénature les protéines du lactosérum (β-lactoglobuline) → améliore la capacité de rétention d'eau et la fermeté du yaourt. - Détruit les enzymes pouvant dégrader la texture. 3. **Refroidissement** : le lait est refroidi à 42–45°C (température d'ensemencement). 4. **Ensemicement** : ajout de la culture starter (1–2% du volume). 5. **Fermentation** : incubation statique à 42–45°C pendant 4–8 heures → - Les bactéries métabolisent le lactose : $$ \text{C}_{12}\text{H}_{22}\text{O}_{11} + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{β-galactosidase}} \text{Glucose} + \text{Galactose} \xrightarrow{\text{Glycolyse}} 2\,\text{Pyruvate} \xrightarrow{\text{Lactate déshydrogénase}} 2\,\text{Lactate}^- + 2\,\text{H}^+ $$ - Production d'acide lactique → baisse du pH du lait de ~6,6 à ~4,0–4,5. - À pH < 4,6, la caséine (protéine principale du lait) atteint son point isoélectrique → perte de charge nette → agrégation en réseau tridimensionnel → **coagulation** (formation du gel). 6. **Refroidissement et maturation** : le yaourt est refroidi à <10°C pour arrêter la fermentation → peut être conservé plusieurs semaines au froid. 7. **Ajout éventuel** : de fruits, de sucre, de arômes (après fermentation, pour éviter l'inhibition des bactéries). ### Propriétés du yaourt - **Texture** : gel doux, onctueux, dû au réseau de caséine piégeant l'eau et le lactosérum. - **Goût** : acidulé (acide lactique), légèrement sucré (résidu de lactose non fermenté). - **Bénéfices santé** : - Source de protéines, de calcium, de vitamines B2 et B12. - Contient des probiotiques (*L. bulgaricus*, *S. thermophilus*) qui peuvent améliorer la digestion du lactose (via leur β-galactosidase résiduelle) et moduler la flore intestinale. - Peut réduire les symptômes d'intolérance au lactose chez certaines personnes. ### Exercices d'application corrigés **Exercice 1** Pourquoi chauffe-t-on le lait à haute température (85–95°C) avant la fabrication du yaourt, alors que la pasteurisation classique ne nécessite que 72°C pendant 15 secondes ? **Corrigé** Le chauffage à haute température (85–95°C) sert à : 1. Dénaturer complètement les protéines du lactosérum, notamment la β-lactoglobuline. Cette protéine, une fois dénaturée, interagit avec la κ-caseine et participe à la formation d'un réseau de caséine plus dense et plus stable → yaourt plus ferme, moins de sérum (whey) séparé. 2. Éliminer complètement toute flore microbienne concurrente (y compris les spores thermorésistantes) qui pourrait interférer avec la culture starter ou produire des goûts indésirables. 3. Inactiver les enzymes protéolytiques et lipolytiques naturelles du lait qui pourraient dégrader la texture ou produire des saveurs rances pendant la fermentation ou le stockage. La pasteurisation classique (72°C/15s) vise uniquement la sécurité microbiologique ; ici, on cherche aussi une modification technologique des protéines pour améliorer la texture. **Exercice 2** Un yaourt fabriqué maison présente une séparation claire d'un liquide clair (sérum) à la surface. Quelle est la cause la plus probable et comment l'éviter ? **Corrigé** La séparation du sérum (synérèse) est due à : - Un réseau de caséine trop faible ou mal formé → incapacité à retenir l'eau. Causes possibles : 1. Température de fermentation trop élevée (>45°C) → croissance trop rapide de l'une des bactéries, déséquilibre symbiotique, production d'acide trop rapide → précipité de caséine fragile. 2. Lait non chauffé suffisamment → pas assez de β-lactoglobuline dénaturée pour renforcer le gel. 3. Utilisation de lait UHT sans ajout de protéines → parfois moins propice à la formation d'un bon gel (dépend du traitement). Pour l'éviter : - Chauffer le lait à 85–95°C pendant 10–20 min avant refroidissement et ensemencement. - Maintenir une température de fermentation stable à 42–45°C. - Utiliser un lait entier ou partiellement écrémé, voire ajouter du lait en poudre pour augmenter la teneur en solides totaux. - Laisser fermenter jusqu'à un pH de 4,4–4,6 (pas trop acide, qui pourrait trop contracter le gel). **Exercice 3** Pourquoi certaines personnes intolérantes au lactose tolèrent-elles mieux le yaourt que le lait ? **Corrigé** Les bactéries du yaourt (*L. bulgaricus* et *S. thermophilus*) produisent de la **β-galactosidase** (lactase) qui reste partiellement active même après l'ingestion. Cette enzyme, présente dans les bactéries vivantes du yaourt, peut hydrolyser une partie du lactose présent dans le yaourt **dans l'intestin grêle**, réduisant ainsi la quantité de lactose reaching le côlon où il serait fermenté par la flore colique, provoquant ballonnements et diarrhée. De plus, la matrice gelée du yaourt ralentit la vidange gastrique, permettant plus de temps à l'enzyme bactérienne pour agir. --- ## V. DNA fingerprinting ### Principe > **DNA fingerprinting (empreinte ADN)** : Technique permettant d'identifier un individu de manière unique à partir de l'analyse de régions spécifiques de son ADN qui présentent un haut degré de polymorphisme entre les individus. Elle repose sur la variation du nombre de répétitions en tandem (VNTR – Variable Number Tandem Repeats) ou de répétitions courtes en tandem (STR – Short Tandem Repeats) dans des loci génomiques non codants. ### Bases moléculaires - Le génome humain contient de nombreuses séquences non codantes où des motifs courts d'ADN sont répétés en tandem. - Le nombre de répétitions varie d'un individu à l'autre en raison de mécanismes de recombinaison inégale lors de la méiose. - Ces loci sont hautement polymorphes : la probabilité que deux individus non apparentés aient le même profil à plusieurs loci est extrêmement faible (< 10⁻⁹). ### Méthode classique (Southern blot, années 1980) 1. **Extraction de l'ADN** : à partir de sang, de salive, de cheveux (follicule), etc. 2. **Digestion par enzymes de restriction** : l'ADN est coupé en fragments par une ou plusieurs enzymes de restriction (ex. : *HinfI*, *DsaV*). 3. **Électrophorèse sur gel d'agarose** : séparation des fragments selon leur taille. 4. **Transfert (blotting)** : les fragments sont transférés sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon. 5. **Hybridation** : la membrane est incubée avec un **probe** marqué (radioactivement ou chimiquement) correspondant à une séquence consensus des VNTR (ex. : probe 33.15 ou 33.6 pour le locus D1S80). 6. **Détection** : révélation du signal → apparition de bandes (un profil) caractéristique de l'individu. 7. **Comparaison** : le profil est comparé à celui d'un autre échantillon (suspect, victime, etc.). ### Méthode moderne (PCR-based STR analysis) Aujourd'hui, l'empreinte ADN utilise principalement la **PCR** pour amplifier des loci STR spécifiques, suivie d'une séparation par électrophorèse capillaire et détection par fluorescence. - **Loci STR couramment utilisés** (ex. : dans le kit CODIS des USA) : - D3S1358, vWA, FGA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, D2S1338, D19S433, etc. - Chaque locus comporte des allèles définis par le nombre de répétitions d'un motif de 2 à 6 pb (ex. : [GATA]ₙ pour TPOX). - La probabilité d'identité aléatoire est calculée en multipliant les fréquences des allèles observés à chaque locus (en supposant l'équilibre de Hardy-Weinberg et l'indépendance des loci). #### Exemple de calcul de probabilité Supposons qu'à un locus donné, un individu ait le génotype 15,18. Si dans la population de référence, la fréquence de l'allèle 15 est 0,12 et celle de l'allèle 18 est 0,09, alors sous l'hypothèse d'équilibre de Hardy-Weinberg : Fréquence du génotype 15,18 = 2 × (0,12) × (0,09) = 0,0216 Si l'on analyse 13 loci indépendants, et que la fréquence moyenne du génotype observé est de 0,01 par locus, alors : Probabilité d'identité aléatoire ≈ (0,01)¹³ = 1 × 10⁻²⁶ Cela signifie qu'une personne choisie au hasard dans la population a une chance sur 10²⁶ d'avoir le même profil ADN. ### Applications - **Identification criminelle** : comparaison de l'ADN trouvé sur une scène de crime (sang, sperme, cheveux) avec celui d'un suspect. - **Tests de paternité/maternité** : comparaison des profils de l'enfant et des parents présumés. Un enfant doit avoir hérité un allèle de chaque locus de chacun de ses parents. - **Identification des victimes de catastrophes** (tremblements de terre, attentats, guerres). - **Généalogie et anthropologie** : étude des migrations humaines, identification de restes historiques. - **Conservation de la biodiversité** : suivi de la parenté dans les programmes d'élevage d'espèces menacées. - **Diagnostic préimplantatoire** : détection de certaines maladies génétiques (moins courant aujourd'hui au profit du séquençage). ### Exercices d'application corrigés **Exercice 1** Dans un test de paternité, l'enfant présente les allèles 12 et 14 au locus D21S11. La mère présente les allèles 12 et 16. Le prétendu père présente les allèles 14 et 18. Peut-on exclure ce prétendu père ? **Corrigé** L'enfant a hérité un allèle de chaque parent. - Allèle 12 : présent chez la mère → compatible (hérité de la mère). - Allèle 14 : présent chez le prétendu père → compatible (hérité du père). Comme l'enfant possède un allèle (14) que le prétendu père possède, et l'autre allèle (12) vient de la mère, **on ne peut pas exclure** ce prétendu père à ce locus. En fait, il est **compatible**. Pour exclure, il faudrait que l'enfant ait un allèle absent chez les deux parents. **Exercice 2** Pourquoi utilise-t-on des loci situés dans des régions non codantes de l'ADN pour l'empreinte ADN, plutôt que des gènes codant pour des protéines ? **Corrigé** Les régions non codantes (comme celles contenant des VNTR ou des STR) sont choisies car : 1. Elles sont **souvent neutres** sur le plan sélectif → pas de pression évolutive réduisant leur variabilité → haut degré de polymorphisme conservé. 2. Les mutations (comme les variations du nombre de répétitions par recombinaison inégale) s'accumulent librement → grande diversité allélique. 3. En revanche, les régions codantes sont souvent soumises à une forte sélection purifiante : les mutations qui altèrent la fonction protéique sont éliminées → moindre variabilité → moins utiles pour discriminer les individus. De plus, l'utilisation de régions non codantes évite les problèmes éthiques liés à la révélation d'informations sur des traits phénotypiques ou des prédispositions à des maladies. **Exercice 3** Un profil ADN obtenu à partir d'une trace de sang sur une scène de crime montre les allèles 10,13 au locus vWA. Un suspect présente les allèles 10,12. Peut-on l'inclure comme correspondant au profil de la trace ? **Corrigé** Non. L'empreinte de la trace contient les allèles 10 et 13. Le suspect possède les allèles 10 et 12. Pour correspondre, le suspect devrait posséder **les deux allèles** présents dans la trace (10 et 13), ou être homozygote pour l'un d'eux si la trace l'était (ce qui n'est pas le cas ici). Comme le suspect n'a pas l'allèle 13, il ne peut pas être la source de la trace. **On peut l'exclure** avec certitude à ce locus. --- ## Synthèse du chapitre - La biotechnologie moderne repose sur la manipulation de l'ADN (ADN recombinant, clonage, expression) pour produire des molécules d'intérêt thérapeutique (insuline humaine) ou pour transformer des matières premières via des microorganismes (levure, bactéries). - La production de l'insuline humaine implique le clonage du gène humain dans *E. coli*, la formation de corps d'inclusion, puis un refolding soigneux pour obtenir la protéine active. - La levure (*Saccharomyces cerevisiae*) est centrale dans la fermentation alcoolique : elle transforme les sucres en éthanol et CO₂, essentielle à la fabrication de la bière, du vin et du pain. - Dans la bière et le vin, le contrôle de la température, de l'oxygène et des souches de levure permet d'orienter le profil aromatique et gustatif. - Dans le pain, le CO₂ produit par la levure lève la pâte grâce au réseau de gluten, tandis que l'alcool et les composés volatils contribuent à l'arôme. - Le yaourt résulte de la fermentation lactique du lait par *L. bulgaricus* et *S. thermophilus* : acidification → coagulation de la caséine → gel caractéristique. La haute température de chauffage du lait améliore la texture en dénaturant les protéines du lactosérum. - L'empreinte ADN (DNA fingerprinting) exploite la variabilité des répétitions en tandem (VNTR/STR) dans l'ADN non codant pour identifier des individus avec une probabilité extrêmement faible de coincidence aléatoire. Elle est utilisée en criminologie, en tests de filiation et en identification de victimes. - Toutes ces applications illustrent comment la compréhension des processus biologiques fondamentaux (réplication, transcription, traduction, fermentation, enzymologie) permet des innovations technologiques majeures en santé, alimentaire et judiciaire. ---