Biochimie appliquée (partie 5/8)

## Objectifs et prérequis **Objectifs** : À l’issue de ce chapitre, l’élève sera capable de : - Décrire la structure stéréochimique du cholestérol et expliquer son rôle dans les membranes cellulaires et la synthèse des stéroïdes. - Interpréter les résultats d’un bilan lipidique (cholestérol total, HDL, LDL, triglycérides) en appliquant la formule de Friedewald et en respectant les normes camerounaises de prévention cardiovasculaire. - Présenter la structure générale des acides aminés, distinguer leurs classifications selon la polarité, la charge et la nature de la chaîne latérale, et calculer leur point isoélectrique à partir des valeurs de pKa. - Expliquer le mécanisme de formation de la liaison peptidique, réaliser le dosage des peptides par la méthode de la ninhydrine et proposer un protocole de synthèse en phase solide adapté à un laboratoire de contrôle qualité des produits alimentaires. - Appliquer les règles d’hygiène et de sécurité propres à la manipulation des réactifs chimiques (solvants organiques, agents de couplage) et identifier les erreurs fréquentes en dosage biochimique. **Prérequis** : Notions de chimie organique (fonctions alcool, amine, acide carboxylique, ester), équilibres acido‑basiques, concept de mole et de concentration, manipulations de base en laboratoire (pipetage, spectrophotométrie, préparation de tampons). --- ## Introduction contextualisée Au Cameroun, les maladies cardiovasculaires représentent près de 30 % des décès prématurés chez les adultes de 30 à 60 ans (source MINSANTE, 2022). Le dépistage du cholestérol et la maîtrise de la qualité protéique des aliments (lait, viande, légumineuses) sont donc des compétences essentielles pour les techniciens de laboratoire, les agents de contrôle qualité en industrie agroalimentaire et les professionnels de santé. Ce chapitre relie la biochimie structurale (cholestérol, acides aminés, peptides) à des applications concrètes : interprétation d’un bilan lipidique, dosage des acides aminés libres dans un aliment, et synthèse contrôlée d’un peptide marqueur pour la détection d’allergènes. --- ## I. Cholestérol : structure, rôle et effets ### 1. Structure chimique du cholestérol Le cholestérol est un stérol à formule brute C₂₇H₄₆O, masse moléculaire 386,65 g mol⁻¹. Il comporte : - Un noyau stéroïdien tétracyclique (trois cycles cyclohexane et un cycle cyclopentane). - Une chaîne latérale hydrocarbonée à huit carbones liée au carbone 17. - Un groupe hydroxyle –OH en position 3 (β‑orientation). - Une double liaison C5=C6 dans le cycle B. > Le cholestérol possède une structure amphipathique : le groupe –OH (polar) interagit avec l’eau, tandis que le noyau stéroïdien hydrophobe et la chaîne latérale s’insèrent dans la bicouche lipidique. ### 2. Biosynthèse et régulation La voie de synthèse (voie de Mevalonate) débute par l’acétyl‑CoA et passe par l’HMG‑CoA réductase, enzyme limitante, inhibée par les statines. Le cholestérol est ensuite esterifié par l’acyl‑CoA:cholestérol acyltransférase (ACAT) pour stockage sous forme d’esters dans les gouttelettes lipidiques. La régulation se fait au niveau : - **Transcriptionnel** : SREBP‑2 (Sterol Regulatory Element‑Binding Protein 2) active la synthèse lorsque le cholestérol libre chute. - **Post‑translationnelle** : phosphorylation de l’HMG‑CoA réductase et dégradation protéasomique. ### 3. Rôle physiologique - Composant essentiel des membranes plasmatiques : modulateur de fluidité et de perméabilité. - Précurseur des acides biliaires (cholate, désoxycholate), des hormones stéroïdiennes (cortisol, aldostérone, testostérone, œstrogènes, progestérone) et de la vitamine D₃ (après UV‑B sur la peau). - Participant à la formation des rafts lipidiques, plateformes de signalisation. ### 4. Effets pathologiques et normes de sécurité Un excès de cholestérol LDL (lipoprotéines de basse densité) favorise l’athérosclérose ; à l’inverse, l’HDL (lipoprotéines de haute densité) effectue le transport inverse du cholestérol vers le foie. **Formule de Friedewald** (valide si TG < 400 mg dL⁻¹) : $$ \text{LDL‑C (mg dL}^{-1}) = \text{TC} - \text{HDL‑C} - \frac{\text{TG}}{5} $$ où TC = cholestérol total, HDL‑C = cholestérol HDL, TG = triglycérides. > Au Cameroun, les valeurs de référence recommandées par le Programme National de Lutte contre les Maladies Non Transmissibles (PNLMNT) sont : TC < 200 mg dL⁻¹, LDL‑C < 130 mg dL⁻¹, HDL‑C > 40 mg dL⁻¹ (hommes) / > 50 mg dL⁻¹ (femmes), TG < 150 mg dL⁻¹. #### Tableau récapitulatif des lipoprotéines | Lipoprotéine | Density (g mL⁻¹) | Apolipoprotéines majeures | Fonction principale | |--------------|------------------|---------------------------|---------------------| | Chylomicrons | <0,95 | ApoB‑48, ApoA‑I, ApoC‑II, ApoE | Transport des triglycérides alimentaires | | VLDL | 0,95‑1,00 | ApoB‑100, ApoC‑I, ApoC‑II, ApoE | Transport des TG hépatique vers tissus | | IDL | 1,00‑1,06 | ApoB‑100, ApoE | Intermédiaire VLDL→LDL | | LDL | 1,06‑1,21 | ApoB‑100 | Transport du cholestérol vers périphérie | | HDL | 1,06‑1,21 | ApoA‑I, ApoA‑II, ApoC, ApoE | Transport inverse du cholestérol | #### Exemple chiffré : calcul du LDL‑C Un patient présente : TC = 225 mg dL⁻¹, HDL‑C = 45 mg dL⁻¹, TG = 180 mg dL⁻¹. $$ \text{LDL‑C}=225-45-\frac{180}{5}=225-45-36=144\text{ mg dL}^{-1} $$ Le LDL‑C dépasse la limite de 130 mg dL⁻¹ → risque atherogène modéré. --- ## II. Acides aminés : structure et propriétés ### 1. Structure générale et classification Un acide aminé α possède un carbone central (Cα) lié à : - Un groupe amine –NH₂ (ou –NH₃⁺ selon pH). - Un groupe carboxyle –COOH (ou –COO⁻ selon pH). - Un atome d’hydrogène. - Une chaîne latérale R spécifique. Il existe 20 acides aminés protéinogènes standards. Ils sont classés selon : | Classe | Critère | Exemples | |--------|---------|----------| | Non polaires, aliphatiques | R hydrophobe | Glycine, Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Méthionine | | Aromatiques | R contenant un cycle aromatique | Phénylalanine, Tyrosine, Tryptophane | | Polaires, non chargées | R contenant –OH, –SH, – amide | Sérine, Thréonine, Cystéine, Asparagine, Glutamine | | Chargées négativement (acides) | R contenant –COO⁻ à pH neutre | Acide aspartique, Acide glutamique | | Chargées positivement (bases) | R contenant –NH₃⁺ à pH neutre | Lysine, Arginine, Histidine | ### 2. Propriétés physico‑chimiques Chaque groupe ionisable possède une constante d’acidité pKa. Les valeurs typiques (à 25 °C, I = 0,1 M) sont : - Groupe α‑COOH : pKa₁ ≈ 2,2 - Groupe α‑NH₃⁺ : pKa₂ ≈ 9,4 - Chaîne latérale : varie (voir tableau ci‑dessous). Le **point isoélectrique (pI)** est le pH auquel la molécule n’a pas de charge nette : $$ \text{pI}= \frac{\text{pKa}_{\text{acide}}+\text{pKa}_{\text{base}}}{2} $$ pour les acides aminés sans chaîne latérale ionisable ; sinon, on moyenne les deux pKa qui entourent la forme zwitterionique. #### Tableau des pKa des chaînes latérales (valeurs approximatives) | AA | Chaîne latérale | pKa (latérale) | |----|-----------------|----------------| | Aspartique (Asp) | –CH₂‑COOH | 3,9 | | Glutamique (Glu) | –(CH₂)₂‑COOH | 4,3 | | Histidine (His) | –CH₂‑imidazole | 6,0 | | Cystéine (Cys) | –CH₂‑SH | 8,3 | | Tyrosine (Tyr) | –CH₂‑phénol | 10,1 | | Lysine (Lys) | –(CH₂)₄‑NH₃⁺ | 10,5 | | Arginine (Arg) | –(CH₂)₃‑NH‑C(=NH₂⁺)‑NH₂ | 12,5 | > La forme zwitterion prédomine entre pKa₁ et pKa₂ ; à pH < pKa₁ l’acide aminé est entièrement protoné (+1), à pH > pKa₂ il est entièrement déprotoné (‑1). ### 3. Réactivité - **Formation de la liaison peptidique** : réaction de condensation entre le groupe α‑COOH d’un AA et le groupe α‑NH₂ d’un autre, libérant une molécule d’eau. - **Décarboxylation** : élimination de CO₂ sous l’action de décarboxylases, donnant des amines biogènes (ex. histamine à partir de l’histidine). - **Transamination** : transfert du groupe amine vers un cétoglutarate, catalysé par les aminotransférases (ALT, AST). - **Réactivité des chaînes latérales** : formation de ponts disulfure (Cys), phosphorylation (Ser, Thr, Tyr), méthylation (Lys, Arg). ### 4. Applications professionnelles - **Dosage des acides aminés libres** dans les farines, les laits et les aliments pour animaux par chromatographie en phase liquide (HPLC) après dérivatisation avec le OPA (ortho‑phthalaldéhyde). - **Contrôle qualité** : vérification du profil d’acides aminés essentiels (lysine, méthionine, tryptophane) conformément aux normes du Codex Alimentarius (ex. teneur minimale en lysine ≥ 5,5 g / 100 g de protéine pour les aliments infantiles). - **Formulation de milieux de culture** : ajout d’acides aminés spécifiques pour soutenir la croissance de lignes cellulaires ou de microorganismes industriels. #### Exemple chiffré : calcul de la charge nette d’un mélange d’acides aminés à pH 7,0 Considérons 1 mmol de lysine (pKa latérale = 10,5) et 1 mmol d’acide glutamique (pKa latérale = 4,3). À pH 7,0 : - Lysine : groupe α‑COOH déprotoné (‑1), α‑NH₃⁺ protoné (+1), chaîne latérale protonée (+1) → charge nette = +1. - Glutamate : α‑COOH déprotoné (‑1), α‑NH₃⁺ déprotoné (0), chaîne latérale déprotonée (‑1) → charge nette = ‑2. Total charge = (+1) + (‑2) = ‑1 mmol. > Un mélange globalement négatif à pH 7 indique un excès d’acides aminés acidifiants, utile pour ajuster le pH des milieux de fermentation. --- ## III. Peptides et liaison peptidique ### 1. Formation de la liaison peptidique La réaction de condensation entre le groupe carboxyle de l’acide aminé i et le groupe amine de l’acide aminé i+1 suit le mécanisme suivant : 1. **Activation** du carboxyle (souvent par formation d’un ester actif ou d’un anhydride mixte). 2. **Attaque nucléophile** de l’amine libre sur le carbone carbonyl, donnant un tétraèdre intermédiaire. 3. **Élimination** de la molécule d’eau (ou du groupe sortant) et formation du lien –CO–NH–. La réaction est thermodynamiquement défavorable en milieu aqueux ; on l’entraîne par : - Utilisation de réactifs de couplage (DCC, EDC, HBTU) en milieu organique anhidre. - Élimination continue de l’eau (séchage moléculaire, distillation azeotropique). > En synthèse peptidique en phase solide (SPPS), l’acide aminé C‑terminal est fixé à une résine polymère (ex. résine Wang pour acide aminé C‑terminal libre, résine Rink amide pour amide C‑terminal). Chaque cycle comprend : déprotection de l’amine (pipéridine pour le groupe Fmoc, acide fort tel que le TFA pour le groupe Boc), couplage avec l’acide aminé suivant activé (par ex. DCC, HBTU), lavage, et répétition. ### 2. Propriétés des peptides - **Solubilité** : dépend de la proportion de résidus polaires/chargés ; les peptides hydrophobes (>50 % de résidus non polaires) sont souvent insolubles dans l’eau et nécessitent des co‑solvants (acétitrile, DMSO). - **Stabilité** : sensibles à l’hydrolyse acide ou basique, à l’oxydation (Méthionine, Cystéine) et à la protéolyse (protéases endogènes). - **Séquençage** : dégradation enzymatique (trypsine, chymotrypsine) ou chimique (Edman degradation) suivie d’analyse par HPLC ou spectrométrie de masse (MALDI‑TOF, ESI‑QTOF). ### 3. Méthodes de dosage - **Méthode de la ninhydrine** : réaction avec les amines libres (α‑NH₂) produisant un complexe bleu‑violet absorbant à 570 nm. Sensibilité ~0,02 µmol. - **Spectrophotométrie UV** : absorption des liaisons peptide (π→π*) autour de 210 nm et des groupes aromatiques (Tyr, Trp, Phe) autour de 280 nm. - **Dosage par réactivité des thiols** (Ellman) pour peptides contenant cystéine. #### Protocole simplifié de dosage ninhydrine (exemple de laboratoire) 1. Préparer une solution étalon de glycine (0‑2 µmol mL⁻¹) dans tampon phosphate pH 8,0. 2. Ajouter 0,5 mL de réactif ninhydrine (0,2 % w/v dans DMSO + acétate de sodium) à 0,5 mL d’échantillon ou d’étalon. 3. Chauffer à 100 °C pendant 15 min, refroidir, ajouter 5 mL d’éthanol 50 % pour développer la couleur. 4. Mesurer l’absorbance à 570 nm contre un blanc (tampon + réactif). 5. Tracer la courbe d’étalon (A = ε·c·l) et déterminer la quantité d’acides aminés libres. > La linéarité de la méthode ninhydrine est respectée jusqu’à 1,5 µmol d’amine ; au‑delà, dilution nécessaire. ### 4. Applications en laboratoire et en industrie - **Synthèse de peptides marqueurs** (ex. peptide GHRP‑6 pour essais de sécrétion d’hormone de croissance) en phase solide, suivi d’une cleavage à l’acide trifluoroacétique (TFA) et purification par HPLC en phase inverse. - **Contrôle qualité des protéines alimentaires** : détermination du degré d’hydrolyse (DH) par la méthode de l’ortho‑phthalaldéhyde (OPA) qui mesure les amines libres libérées lors de la protéolyse. - **Formulation de compléments nutritionnels** : ajout de peptides de collagène hydrolysé (peptides de 2‑10 aa) pour améliorer la biodisponibilité des acides aminés. #### Exemple de calcul de quantité de réactif pour SPPS On souhaite synthétiser un tétrapéptide Ala‑Gly‑Phe‑Leu (sequence du N‑terminale au C‑terminale) sur une résine de capacité 0,6 mmol g⁻¹. On utilise 100 mg de résine → capacité théorique = 0,06 mmol. Pour assurer un excès de 3 équivalents lors du couplage, on prépare : $$ n_{\text{AA}} = 3 \times 0,06\ \text{mmol}=0,18\ \text{mmol} $$ Masse d’acide aminé (ex. Fmoc‑Ala‑OH, M = 299,37 g mol⁻¹) : $$ m = 0,18\times10^{-3}\ \text{mol}\times 299,37\ \frac{\text{g}}{\text{mol}}=0,0539\ \text{g}\approx 54\ \text{mg} $$ On répète le même calcul pour chaque AA (ajustant la masse selon leur poids moléculaire). > Un excès de 2‑3 équivalents est standard pour garantir un rendement de couplage > 98 % par étape. --- ## Synthèse du chapitre - **Cholestérol** : stérol C₂₇H₄₆O, amphipathique, précurseur des hormones stéroïdiennes et des acides biliaires ; régulation via SREBP‑2 et HMG‑CoA réductase ; interprétation du bilan lipidique avec la formule de Friedewald (LDL‑C = TC – HDL‑C – TG/5). - **Acides aminés** : structure α‑amine/α‑acide + chaîne latérale R ; classification selon polarité, charge, aromaticité ; propriétés acido‑basiques (pKa₁≈2,2, pKa₂≈9,4, pKa latérale variable) ; point isoélectrique pI = moyenne des deux pKa entourant la forme zwitterion ; réactivité : formation de liaisons peptidiques, décarboxylation, transamination. - **Peptides** : liaison peptidique formée par condensation (–CO–NH–) avec libération d’eau ; synthèse en phase solide (SPPS) utilisant des protecteurs Fmoc/Boc et des agents de couplage (DCC, HBTU) ; propriétés : solubilité, stabilité, séquençage (Edman, enzymatique, MS) ; dosage : ninhydrine (570 nm), UV (210/280 nm), thiols (Ellman) ; applications : contrôle qualité des protéines, formulation de compléments, synthèse de peptides bioactifs. --- ## Glossaire | Terme | Définition | |-------|------------| | Cholestérol | Stérol C₂₇H₄₆O, composant essentiel des membranes et précurseur des hormones stéroïdiennes. | | Lipoprotéine | Particule composée de lipides et d’apolipoprotéines permettant le transport des lipides dans le sang. | | LDL‑C | Cholestérol transporté par les lipoprotéines de basse densité, considéré comme « mauvais » lorsqu’il est élevé. | | HDL‑C | Cholestérol transporté par les lipoprotéines de haute densité, jouant un rôle protecteur (« bon »). | | Acide aminé α | Molécule contenant un groupe amine, un groupe carboxyle, un hydrogène et une chaîne latérale R liée au même carbone α. | | Zwitterion | Forme dipolaire d’un acide aminé où le groupe amine est protoné (NH₃⁺) et le groupe carboxyle déprotoné (COO⁻), donnant une charge nette nulle à son pI. | | Point isoélectrique (pI) | pH auquel une espèce ampholyte (acide aminé, peptide) présente une charge nette nulle. | | Liaison peptidique | Liaison amide –CO–NH– formée par condensation entre le groupe carboxyle d’un acide aminé et l’amine d’un autre, avec libération d’eau. | | SPPS (Synthèse en Phase Solide) | Méthode de synthèse peptidique où le peptide est ancré à une résine insoluble, permettant des cycles de déprotection, couplage et lavage. | | Méthode de la ninhydrine | Réaction colorimétrique détectant les amines libres (α‑NH₂) produisant un complexe absorbant à 570 nm. | | Degré d’hydrolyse (DH) | Pourcentage de liaisons peptidiques rompues lors d’une hydrolyse enzymatique ou chimique d’une protéine. | | Fmoc | 9‑Fluorenylméthoxycarbonyl, groupe protecteur de l’amine utilisé en SPPS, enlevé par la pipéridine. | | Boc | tert‑Butoxycarbonyl, groupe protecteur de l’amine enlevé par acide fort (ex. TFA). | | DCC | N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide, agent de couplage activant les acides carboxyliques pour la formation de liaisons peptidiques. | | TFA | Acide trifluoroacétique, utilisé pour couper le peptide de la résine en SPPS et éliminer les groupes protecteurs tert‑butyle. | --- ## Exercices d'application corrigés ### Exercice 1 – Interprétation d’un bilan lipidique Un patient de 45 ans présente les résultats suivants : TC = 260 mg dL⁻¹, HDL‑C = 38 mg dL⁻¹, TG = 210 mg dL⁻¹. **a)** Calculer le LDL‑C à l’aide de la formule de Friedewald. **b)** Selon les références camerounaises (TC < 200, LDL‑C < 130, HDL‑C > 40 mg dL⁻¹ pour les hommes, TG < 150 mg dL⁻¹), interpréter les résultats. **c)** Proposer une mesure hygiéno‑diététique prioritaire. **Corrigé** **a)** $$ \text{LDL‑C}=260-38-\frac{210}{5}=260-38-42=180\text{ mg dL}^{-1} $$ **b)** - TC = 260 > 200 → hypercholestérolémie. - LDL‑C = 180 > 130 → LDL‑c élevé, risque atherogène important. - HDL‑C = 38 < 40 → HDL bas, facteur de risque supplémentaire. - TG = 210 > 150 → hypertriglycéridémie. Le profil lipidique est défavorable : risque élevé de maladie cardiovasculaire athéroscléreuse. **c)** Mesure prioritaire : réduction des apports en graisses saturées et en sucres simples, augmentation de l’activité physique (au moins 150 min/semaine d’activité modérée) et, si nécessaire, initiation d’une statine après avis médical. --- ### Exercice 2 – Dosage d’acides aminés libres par la méthode de la ninhydrine Un extrait de farine de maïs est dilué 1 : 10 dans du tampon phosphate pH 8,0. Après réaction avec la ninhydrine, l’absorbance mesurée à 570 nm est 0,420. La courbe d’étalon obtenue avec des solutions de glycine donne l’équation : $$ A = 0,025\,c\;(\mu\text{mol mL}^{-1}) + 0,005 $$ où *A* est l’absorbance et *c* la concentration en µmoles par mL. **a)** Déterminer la concentration d’acides aminés libres dans l’extrait dilué. **b)** Calculer la concentration dans l’extrait non dilué (farine de maïs). **c)** Exprimer le résultat en mg d’acide aminé équivalent glycine par gramme de farine, sachant que la masse moléculaire de la glycine est 75,07 g mol⁻¹. **Corrigé** **a)** Résolution de l’équation pour *c* : $$ 0,420 = 0,025c + 0,005 \;\Rightarrow\; 0,025c = 0,415 \;\Rightarrow\; c = \frac{0,415}{0,025}=16,6\ \mu\text{mol mL}^{-1} $$ **b)** L’extrait a été dilué 1 : 10, donc la concentration dans l’échantillon non dilué est : $$ c_{\text{non dilué}} = 16,6 \times 10 = 166\ \mu\text{mol mL}^{-1} $$ **c)** Conversion en masse : $$ 166\ \mu\text{mol mL}^{-1} = 166 \times 10^{-6}\ \text{mol mL}^{-1} $$ Masse par mL : $$ m = 166 \times 10^{-6}\ \text{mol}\times 75,07\ \frac{\text{g}}{\text{mol}} = 0,01246\ \text{g mL}^{-1}=12,46\ \text{mg mL}^{-1} $$ En supposant une densité proche de 1 g mL⁻¹ pour l’extrait, cela correspond à environ **12,5 mg d’acide aminé équivalent glycine par gramme de farine**. --- ## Erreurs fréquentes et règles de sécurité | N° | Erreur fréquente | Conséquence | Règle de prévention / bonne pratique | |----|------------------|-------------|--------------------------------------| | 1 | Utilisation de la formule de Friedewald quand TG > 400 mg dL⁻¹ | Sous‑ ou sur‑estimation du LDL‑C, mauvaise interprétation du risque | Vérifier le taux de TG avant d’appliquer la formule ; si TG > 400 mg dL⁻¹, recourir à la mesure directe du LDL‑C (ultracentrifugation ou méthode enzymatique). | | 2 | Oublier de neutraliser le milieu après ajout d’acide fort (ex. TFA) en SPPS | Dégradation du peptide par acide résiduel, perte de rendement | Après cleavage, précipiter le peptide dans de l’éther froid, le laver plusieurs fois avec de l’eau ou du tampon neutre avant lyophilisation. | | 3 | Utiliser des pipettes non calibrées pour doser les réactifs de couplage (DCC, HBTU) | Couplage incomplet, formation de produits de côté, baisse du rendement global | Vérifier la calibration des pipettes avant chaque série de manipulations ; préparer des solutions maîtresses à concentration connue et utiliser des pipettes volumétriques pour les volumes > 1 mL. | | 4 | Chauffer trop longtemps le mélange ninhydrine‑échantillon (> 20 min) | Décoloration, formation de composés parasites qui absorbent à 570 nm, surestimation de la concentration | Respecter strictement le temps de chauffe (15 min à 100 °C) indiqué dans le protocole ; utiliser un minuteur et un bloc chauffant à température contrôlée. | | 5 | Négliger le port de gants nitrile lors de la manipulation du phénylisothiocyanate (PITC) utilisé dans la dégradation d’Edman | Irritation cutanée, sensibilisation, risque de toxicité systémique | Porter systématiquement des gants nitrile, des lunettes de protection et travailler sous hotte lorsqu’on manipule le PITC ou tout réactif aromatique volatil. | | 6 | Stocker les solvants organiques (acétitrile, DMSO) à température ambiante sans étiquetage clair | Risque de confusion, utilisation de solvant périmé pouvant contenir de l’eau ou des peroxydes, échec de la réaction | Étiqueter clairement chaque flacon avec nom, date de réception et date de péremption ; conserver les solvants dans un armoire ventilée, à l’écart des sources de chaleur, et vérifier la présence de peroxydes (bandes test) avant usage. | --- *Fin du cours.*